Julio-Septiembre 2012 51
ISSN 1317-987X
 
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Artículos
 




Virología
Mecanismos de acción de compuestos antivirales aislados en plantas: el Virus de la Inmunodeficiencia Humana como modelo.

Compuestos naturales de plantas con actividad anti-VIH

En los últimos años se han descubierto en las plantas una amplia gama de moléculas que inhiben la infección por VIH, al actuar sobre diferentes etapas del ciclo de replicación viral, desde fases tempranas hasta fases más tardías.
 
Sustancias que actúan en etapas tempranas del ciclo de replicación viral.
Se considera que la adsorción de la partícula viral y la fusión a la célula diana constituyen las etapas tempranas del ciclo de replicación viral. Se han identificado compuestos que son capaces de actuar solamente sobre dichas fases, inhibiendo así la entrada del virus a la célula hospedadora.
 
Los inhibidores de la adsorción: la fracción polisacárida de Rhizophora apiculata.
Los manglares del género Rhizophora se encuentran distribuidos a lo largo de las costas orientales de África, así como en el sureste de Asia y en Oceanía. Las hojas y la corteza de estas plantas han sido tradicionalmente utilizadas en esas regiones como antisépticos y para tratar diarreas, fiebres, disentería, lepra y malaria (Duke, 2005). En tal sentido, un grupo de investigadores tomó la iniciativa de estudiar el efecto antiviral de esta planta sobre la infección por VIH. Estudios previos habían demostrado que los polisacáridos sulfatados son inhibidores de la multiplicación in vitro del VIH 1 y 2, siendo la heparina, el pentosan polisulfato y los sulfatos de dextrina y dextrano los de mayor efecto. Estos compuestos inhiben la adsorción viral al interferir en la unión de la proteína gp120 al receptor CD4 (Cos et al, 2004). Así, Premanathan et al. (1999) decidieron investigar si se obtenía el mismo efecto sobre el VIH con las fracciones polisacáridas obtenidas de las hojas de Rhizophora apiculata (RAP). Para ello, los autores realizaron la purificación previa de los polisacáridos de la hoja de la planta y luego elaboraron ensayos de inhibición de la citopatogenicidad y replicación del virus.
 
Para estimar la inhibición de la citopatogenicidad, Premanathan et al. (1999) investigaron el efecto de RAP sobre la viabilidad celular y la formación de sincitios en células infectadas con VIH. La disminución de la viabilidad celular fue determinada a través de la disminución de la actividad de una deshidrogenasa mitocondrial, medida por la acción de esta enzima sobre el sustrato MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2 il)-2,5- difenil-tetrazolio), el cual es oxidado originando un producto cristalino azul que puede solubilizarse en medio ácido y cuya absorbancia se mide a 540 nm (Pauwels et al, 1988). La inhibición de la formación de sincitios fue determinada mediante el método de exclusión de azul de tripano. Este último es un colorante que sólo penetra en las células que han perdido la integridad de su membrana plasmática (Pauwels et al, 1988), así que aquellas que formen sincitios incorporarán el compuesto. Por otro lado, Premanathan et al. (1999) estimaron la inhibición de la replicación mediante la producción de antígenos virales y la Activación Multinuclear del Indicador de la Galactosidasa (en inglés, MAGI). La medición de antígenos virales se realizó mediante el método de inmunofluorescencia indirecta, mientras que la detección específica de la proteína p24 se hizo por el método de ELISA. El ensayo MAGI permite determinar el número de partículas infecciosas de VIH en una muestra particular y se basa en la expresión de la enzima β-galactosidasa en células transfectadas con el gen lacZ (células MAGI). Este se encuentra asociado al promotor viral Tar, por lo que su transcripción sólo se inicia cuando el virus penetra a las células e inicia su replicación, produciendo la proteína Tat que controla la transcripción genética al unirse a Tar. El número de células infectadas se puede calcular contando todas aquellas que se tornan azules en presencia de un sustrato adecuado de la β-galactosidasa (Kimpton y Emerman, 1992). En todos los ensayos anteriores, los autores demostraron que las fracciones RAP inhibían la replicación viral y la citopatogenicidad causada por cepas de VIH-1 y 2 en diversas células de cultivo (Premanathan et al, 1999). En efecto, a concentraciones relativamente bajas, los compuestos ensayados disminuyeron a la mitad el número de células azules en ensayos MAGI (ver en la Tabla 3 la EC50, definida como la concentración efectiva de polisacáridos necesaria para reducir en un 50% la citopatogenicidad inducida por el virus o la replicación viral). Al evaluar la citotoxicidad de los compuestos sobre células no infectadas, se registró un daño celular considerable a concentraciones altas de los polisacáridos (ver la CC50 en la Tabla 3, que representa la concentración de RAP necesaria para disminuir en un 50% la viabilidad de células sanas), generando un índice de selectividad alto (SI = CC50/EC50) que reflejó cuan aptos eran los compuestos para disminuir la replicación viral sin causar daño a las células. En células T MT-4 infectadas con diferentes cepas de VIH 1 y 2, los polisacáridos inhibieron efectivamente (índice de selectividad > 100) la citopatogenicidad y la producción de antígenos virales asociadas a las infecciones virales (ver Tabla 3). No obstante, tuvieron un menor efecto inhibitorio sobre cepas resistentes a dos INNRT como la nevirapina (HE-NEV) y la emivirina (IIB-R), sugiriendo la posibilidad de que RAP actúe sobre la RT viral de forma similar a estos inhibidores. La prevención de la formación de sincitios entre células T infectadas con VIH-1 y células T sanas, fue directamente proporcional a la cantidad de RAP, pero la concentración necesaria para obtener una inhibición del 50% fue 4 veces mayor a la de sulfato de dextrano.

La EC50 representó la concentración de compuesto necesaria para disminuir en un 50% el número de células MAGI azules y la cantidad de antígenos virales con relación a los controles no tratados con el extracto. En el caso de los ensayos colorimétricos con MTT, la EC50 se definió como la cantidad de RAP requerida para aumentar en un 50% la absorbancia de las células con relación a células no expuestas a RAP. La CC50 fue la concentración de extracto que disminuyó en un 50% la viabilidad celular con respecto a células sanas no expuestas a los compuestos. El índice de selectividad (SI) representa cociente CC50/EC50 (Premanathan et al, 1999). Los ensayos de detección de p24 realizados en células periféricas mononucleares de la sangre (PBMC) mostraron un EC50 relativamente alto en relación con el CC50, obteniendo un SI bastante bajo (44), lo que reflejó una menor eficiencia de RAP a la hora de inhibir la infección en células mononucleares aisladas de pacientes sanos (Premanathan et al, 1999). 
 
Tabla 3. Actividad anti-VIH de RAP sobre diversas líneas celulares infectadas con diferentes cepas virales.
 
 

La EC50 representó la concentración de compuesto necesaria para disminuir en un 50% el número de células MAGI azules y la cantidad de antígenos virales con relación a los controles no tratados con el extracto. En el caso de los ensayos colorimétricos con MTT, la EC50 se definió como la cantidad de RAP requerida para aumentar en un 50% la absorbancia de las células con relación a células no expuestas a RAP. La CC50 fue la concentración de extracto que disminuyó en un 50% la viabilidad celular con respecto a células sanas no expuestas a los compuestos. El índice de selectividad (SI) representa cociente CC50/EC50 (Premanathan et al, 1999)

Debido a que los polisacáridos sulfatados con actividad antiviral actúan al nivel de la adsorción del virus, los mismos autores decidieron estudiar si el efecto antiviral de RAP se debía a su interacción sobre la unión de los viriones a células T. Para tal fin, las células MT-4 se infectaron con una cepa de VIH-1 en presencia o ausencia de RAP y se incubaron con un anticuerpo policlonal aislado de un paciente infectado con VIH. Posteriormente se agregó un anticuerpo de conejo dirigido contra las inmunoglobulinas humanas y conjugado a fluoresceína, una molécula que fluorece a determinada longitud de onda. Las células marcadas de este modo se analizaron en un citómetro de flujo (Schols et al, 1989). En las células infectadas tratadas con el extracto, los dos picos de fluorescencia se solaparon (Figura 5), indicando un bloqueo en la unión de los anticuerpos primarios anti-VIH a los viriones. Por lo tanto concluyeron que RAP actuaba inhibiendo la adsorción viral, lo que se vio confirmado al medir la expresión del RNAm viral mediante ensayos cuantitativos de RT-PCR. En este último ensayo, al tratar las células con los polisacáridos durante la adsorción viral se redujo significativamente la cantidad de RNAm viral, mientras que al tratar las células después de la fase de adsorción no se observó efecto.

Figura 5. Efecto de RAP sobre la unión del VIH-1 a células MT4. El pico de área blanca representa la fluorescencia resultante de la unión inespecífica de los anticuerpos anti-VIH-1 a las células sin infectar, mientras que el pico de color negro representa la fluorescencia provocada por la unión específica de los anticuerpos a las células infectadas con el VIH-1 en ausencia (A) y en presencia de 100 μg/mL de RAP (B) (Premanathan et al, 1999).

Por otro lado, Premanathan et al. (1999) observaron que RAP previno la formación de sincitios sin afectar la unión de anticuerpos dirigidos contra CD4, CXCR4 y CCR5, indicando que la inhibición de la adsorción podría deberse a la interacción de RAP con la proteína gp120. Los grupos sulfato de muchos polisacáridos son los responsables de este efecto. Sin embargo, no se detectaron grupos sulfatados en las fracciones RAP, representando una categoría novedosa de polisacáridos con propiedades anti-VIH (Premanathan et al, 1999). En la prevención de la adsorción podrían estar interviniendo los grupos carboxilados de los ácidos urónicos detectados en las fracciones RAP. Estos, al igual que los grupos sulfatados, tienen un carácter aniónico y podrían interactuar con los residuos básicos de gp120.

Introducción
Mecanismos de replicación del VIH
Compuestos naturales de plantas con actividad anti-VIH
Otros inhibidores de la adsorción: el ácido repandusínico de Phyllanthus niruri.
Compuestos que actúan a nivel de la replicación intracelular
Conclusiones
Referencias

NOTA: Toda la información que se brinda en este artículo es de carácter investigativo y con fines académicos y de actualización para estudiantes y profesionales de la salud. En ningún caso es de carácter general ni sustituye el asesoramiento de un médico. Ante cualquier duda que pueda tener sobre su estado de salud, consulte con su médico o especialista.





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