Se realizó un muestreo no probabilístico, las muestras fueron recolectadas en el periodo comprendido desde enero 2014 a enero 2015, un total de 150 muestras de heces provenientes de infantes menores a 5 años, que acudieron a dos centros médicos: Servicio autónomo del Hospital Universitario de la ciudad de Maracaibo (SAHUM) y Seguro Social del municipio Jesús Enrique Lossada (IVSS).

Los criterios de inclusión fueron: niños menores de 5 años, de ambos sexos con síndrome diarreico, vacunados o no y que no hubiesen recibido tratamiento terapéutico. Se seleccionaron 30 muestras de heces de niños que no presentaron síndrome diarreico y se tomaron como grupo control.

Se elaboraron encuestas para obtener la mayor información del paciente, tales como: edad, sexo, procedencia, manifestaciones clínicas y características de las evacuaciones. Se tomaron en cuenta las pautas establecidas por la Asociación Médica Mundial (AMM) contenidas en la declaración de Helsinki(15), así como la previa autorización por escrito de los padres y representantes. Tanto el consentimiento previo como la encuesta realizada fueron aprobados por el comité de Bioética del SAHUM y de la facultad de Medicina.

Las muestras de heces se recolectaron en envases plásticos de 3 onzas y se transportaron en refrigeración (entre 2 y 8 °C), luego se almacenaron a temperatura de -20 °C y posteriormente se analizaron en el Laboratorio Regional de Referencia Virológicas de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia; donde se evaluaron macroscópicamente en cuanto a consistencia, presencia o ausencia de moco y sangre.

Para la detección del antígeno de Rotavirus grupo A en muestras fecales por el método inmunológico de Aglutinación directa en partículas de látex. se utilizó un reactivo comercial (Rotaviruses Latex) de Plasmatec Olga ®, el cual está compuesto por partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo que permiten la detección del antígeno por aglutinación. El estuche posee todos los reactivos necesarios para realizar la prueba como son el control positivo (listo para su uso) y la solución tampón; Así como los implementos necesarios (Láminas de Aglutinación, pipetas y mezcladores) (16).

Se consideró como un resultado positivo, la aglutinación macroscópica de las partículas de látex del reactivo. Teniendo gran significado una aglutinación fuerte; mientras que, el resultado negativo se evidenció, al observarse una apariencia lechosa sin ninguna agregación visible de las partículas de látex (16). Cabe destacar que esta técnica tiene una sensibilidad del 93,7% y altos valores de especificidad; por tanto, fue utilizada para seleccionar las muestras para su posterior confirmación por técnicas de biología molecular.

El ARN viral en cada muestra se extrajo realizando una suspensión de las muestras fecales al 10% (clarificado fecal); para ello, se agitó vigorosamente en agua libre de nucleasas aproximadamente 0,1 gr de heces sólidas ó 100 ul de heces líquidas, luego fueron centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos a 4°C, finalmente se guardó la muestra a -20°C hasta su próximo procesamiento (14).

Extracción de ARN genómico: Para esta etapa se empleó el sistema comercial de extracción de ARN viral (Qiagen, QIAamp Viral RNA Mini Kit), siguiendo las indicaciones del fabricante.

Detección del genoma viral: Se realizó mediante una retrotranscripción (RT), seguida de una PCR, específica para una región conservada del genoma, específicamente VP4. Para la RT se emplearon hexámeros aleatorios, los cuales se utilizaron para obtener teóricamente ADN complementario (ADNc) de todos los ARNs que haya en la mezcla. Implementando posteriormente PCR para amplificar parte del gen de la proteína de la cápside externa de Rotavirus: VP4, mediante el empleo de primers específicos (Tabla 1) y siguiendo los protocolos descritos por Abbasgadezan (17). Para detectar un fragmento de 211 pb, utilizando como control Positivo una muestra previamente procesa en el instituto de investigaciones científicas de Venezuela (IVIC- Caracas) y como control Negativo agua libre de nucleasas.

Tabla 1. Oligonucleótidos iniciadores utilizados en la Técnica RT-PCR para la detección de Rotavirus (17).

Electroforesis en gel de agarosa: Los productos obtenidos en la PCR se analizaron en geles de agarosa al 1,5% en buffer Tris-Borato EDTA (TBE) teñdo con 2μg/μL de bromuro de etidio. La electroforesis se realizó a 500mA de corriente y a un voltaje de 120 V por 40 minutos. Una vez culminada la electroforesis se observó el gel en un transiluminador UV Pro. Como marcador de peso molecular se empleó el marcador de 100 a 1000pb Kb DNA plus de Promega ® (17).

Se consideraron como muestras positivas aquellas que revelaron la presencia de una banda de 211pb correspondiente a la región VP4, la muestra se considera negativa si aparece solamente una banda de 100pb. La reacción se consideró inhibida cuando no apareció ninguna banda.

Los resultados se expresaron en media ± desviación estándar, valores absolutos y porcentajes. La normalidad de los datos fue explorada por la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las variables cuantitativas fueron comparadas utilizando la técnica estadística U de Mann-Whitney. Las variables cualitativas se analizaron a través de la prueba de chi cuadrado de Pearson. Se tomó como índice de confianza el 95% y se consideró como significativo un valor de probabilidad menor a 0,05 (p<0,05). Para ello, se empleó el programa estadístico SPSS ® para Windows, versión 21.0.