Cepa de Blastocystis sp.

La cepa de Blastocystis sp. utilizada fue obtenida a partir de la muestra de heces de un paciente de 5 años de edad de sexo masculino, quien presentó diarrea, dolor abdominal y flatulencia. La muestra de heces fue procesada mediante examen directo con solución salina fisiológica y Lugol para determinar la presencia de Blastocystis sp.⁽³⁷⁾.

Muestra animal

Se utilizaron intestinos delgados de ratones Bio-NMRI, suministrados por el Bioterio Central de la Universidad de Los Andes. El manejo de los animales se hizo de acuerdo a lo establecido por el Comité de Bioética de la Universidad de Los Andes para el Uso de Animales Experimentales^(38,39), según exigencias establecidas en las Normas para la Utilización de Animales en Investigación contenidas en el Código de Bioética y Seguridad del Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (FONACIT-Caracas, Venezuela)⁽³⁹⁾.

Se utilizaron 25 ratones adultos jóvenes sanos, de 60 días de edad postnatal (P60), con un peso promedio de 30 gramos, los cuales se mantuvieron sin ingerir alimento sólido 24 horas previas al ensayo, para eliminar el contenido intestinal. Los ratones se anestesiaron por inyección intradérmica con 240 mg/Kg-peso de Ketamina®. Una vez anestesiado el ratón se le practicó una incisión abdominal de aproximadamente 2 cm para exponer las asas intestinales. Un 20% de las muestras se utilizaron como control sin someterlas a condiciones de cultivo.

Cultivos de intestino delgado y co-cultivos de intestino delgado con Blastocystis sp.

En un ambiente aséptico se obtuvieron muestras cilíndricas de intestino delgado de ratón, las cuales fueron liberadas de restos de contenido intestinal mediante lavados sucesivos con solución Tyrode.

Un grupo de segmentos intestinales provenientes del 60% de los animales utilizados, fue cultivado conjuntamente con el microorganismo. Para esto, un extremo de cada segmento intestinal se cerró con sutura quirúrgica y por el otro extremo abierto se introdujo el cultivo de Blastocystis sp., a una concentración de 10.000 células/ml; posteriormente, este segundo extremo fue también cerrado con sutura quirúrgica. Inmediatamente, se procedió a cultivar estos cilindros intestinales conteniendo las células de Blastocystis sp. durante 24, 48 y 72h, en medio de cultivo reconstituido, el cual se oxigenó cada 12h y se cambió cada 24h. Un 20% de las muestras restantes se les hizo el mismo procedimiento de cerramiento de los extremos para formar cilindros intestinales pero sin la presencia del microorganismo y fueron cultivadas durante 24, 48 y 72h, con la finalidad de conocer el comportamiento del tejido en condiciones in vitro, pero sin ser sometido a ningún agente patógeno.

Tanto estos grupos control como los experimentales fueron incubados en medio de cultivo, constituido por: medio basal de Eagle (98,98 %), suero de caballo (1%), penicilina/estreptomicina 5000 UI/ 5000 microgramos (0,01%) y L-glutamina (0,01%). El medio de cultivo se oxigenó cada 12h y se cambió cada 24h ^(40-42). El tiempo de incubación programado fue de 1 a 3 días, de acuerdo a experiencias previas⁽³³⁾.

Preparación de material para observación microscópica

Se procedió a la fijación de muestras de intestino delgado sin cultivar (20%), muestras control de intestino delgado cultivado sin presencia de Blastocystis sp. (20%) y muestras de co-cultivo intestino delgado – Blastocystis sp. (60%). Para la fijación se utilizó mezcla 3:3⁽⁴³⁾, la cual contiene 3 % de glutaraldehído y 3 % de formaldehído diluidos en tampón cacodilato de sodio 0,1 M y pH 6,3. El período de fijación fue entre 4 a 6 horas, a 4° C. Después que los tejidos fueron lavados con abundante solución tampón, fueron postfijados con tetraóxido de osmio al 1% preparado en tampón cacodilato 0,1 M, pH 6,3, en el cual permanecieron durante 12 a 16h a 4°C. Se lavaron nuevamente con solución tampón y se procedió a deshidratar los tejidos con alcohol etílico a concentraciones ascendentes y con óxido de propileno. Una vez concluida la deshidratación, el tejido fue infiltrado e incluido en resina epoxídica (Eponate®).

Cortes de 1 µm de espesor fueron coloreados con p-fenil-endiamina y observados en un microscopio de luz de alta resolución Polyvar Reichert-Jung. Para el análisis ultraestructural, se realizaron cortes de 90 nm de espesor, los cuales fueron contrastados con una modificación a los métodos clásicos de Watson y Reynolds^(44-46). Para la observación del material se utilizó un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7000.