Agosto-Octubre 2000 5
ISSN 1317-987X
 
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Artículos
 



Neurociencia
Transducina: La proteína G del proceso de excitación visual

Sitios de Interacción en el complejo Tb g

La formación de entrecruzamientos covalentes inter o intramoleculares entre residuos de aminoácidos específicos en proteínas es una herramienta muy valiosa en el área de la química de proteínas. Su uso principal ha sido en el estudio de interacciones proteína-proteína. Por un lado se puede inducir entrecruzamientos de longitud cero, en los cuales las cadenas polipeptídicas se unen por grupos funcionales que ya existen en las proteínas, y por lo tanto no requieren del empleo de grupos espaciadores. En este caso, el agente entrecruzador sirve como catalizador de la mencionada reacción. Sin embargo, también existe una gran variedad de reactivos bifuncionales. En estos compuestos, los dos grupos reactivos están separados por una cadena espaciadora que posee una longitud fija específica, la cual permite determinar la distancia a la que se encuentran los dos residuos que están siendo entrecruzados. Experimentos con reactivos entrecruzadores han ayudado a definir más claramente los residuos que están interactuando entre las subunidades b y g de la transducina.

Al incubar transducina o el complejo Tb g con fenantrolina cúprica (CuPh), un reactivo que cataliza la formación de enlaces bisulfuros entre grupos sulfhídricos convenientemente situados, se observó la formación de una nueva banda polipeptídica de 43 kDa. La banda solamente se formó bajo condiciones no reductoras, y no fue observada cuando la muestra fue electroforizada en presencia de b -mercaptoetanol. Además, la formación de la especie de 43 kDa se evitó cuando las mezclas de incubación fueron tratadas con N-etilmaleimida y EDTA previo a la adición de CuPh. La banda de 43 kDa apareció de forma proporcional con la desaparición de la subunidad b , y estudios cinéticos mostraron su completa formación en aproximadamente 30-45 min. Además, el análisis por electroforesis bidimensional (no reductora-reductora) mostró la presencia de Tb y Tg en la banda de 43 kDa. Estos resultados muestran que la formación de la especie de 43 kDa involucra enlaces bisulfuros entre las subunidades b y g de la transducina.

A fin de identificar los residuos de aminoácidos participantes en el enlace bisulfuro, una muestra de transducina fue incubada con CuPh en escala preparativa, terminándose la reacción con la adición de N-etilmaleimida y EDTA. Como control, una muestra de transducina fue incubada con N-etilmaleimida y EDTA previo a la incubación con CuPh. Posteriormente, ambas muestras fueron reducidas con ditiotreitol como agente reductor, desnaturalizadas, tratadas con [3H] ácido iodoacético (IAA), digeridas con tripsina, y los productos resultantes separados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Dos picos radioactivos aparecieron en los perfiles cromatográficos de la muestra tratada con CuPh, los cuales estaban ausentes en la muestra control. Estos picos fueron recromatografiados a fin de limpiarlos a homogeneidad y fueron sujetos a secuenciación de fase gaseosa. Los residuos involucrados en el enlace bisulfuro inducido por CuPh fueron identificados como Cys25 en Tb y Cys36 y/o Cys37 en Tg . Estos experimentos nos llevaron a concluir que estas cisteínas constituyen un punto de contacto entre las subunidades b y g de la transducina tanto en el heterotrímero como en el complejo Tb g .

Tomando como base la estructura cristalina reportada tanto para Tb g , como para la transducina, las distancias entre los carbonos a de la Cys25 de Tb y la Cys36 de Tg , o de la Cys25 de Tb y la Cys37 de Tg son 10.19 Å y 11.78 Å, respectivamente. Estas distancias sugieren que dichos residuos están localizados convenientemente para sufrir el entrecruzamiento observado por efecto del tratamiento con CuPh. La figura 9 ilustra como el puente bisulfuro inducido por CuPh es consistente con dicha estructura cristalina, y demuestra que estas cisteínas tienen la orientación apropiada y están próximas entre sí, lo que conlleva a la formación del mencionado enlace bisulfuro.

Figura 9. Modelo construido al anclar la conformación por RMN del undecapéptido C-terminal de Ta a la estructura de rayos X de la transducina. La figura muestra la conformación enlazada a R* del péptido C-terminal de Ta resuelto por RMN (verde) (Kisselev et al., 1999), anclado a la estructura cristalina de la transducina, enlazada a GDP, resuelta por difracción de rayos X (Lambright et al., 1996), con Ta en amarillo, Tb en rojo, y Tg en azul. La localización hipotética de la membrana, que representa la superficie del heterotrímero que interactúa con R*, puede observarse abajo (línea blanca). En la figura se identifica la localización de los residuos de cisteínas modificados por IAA, así como los sitios involucrados en el entrecruzamiento inducido por CuPh.

El proceso visual y su cascada de señalización
Estructura de la transducina
Sitios de Interacción en el complejo Tb g
Modificación química de las cisteínas de la transducina
Requerimientos de lípidos en la función de la rodopsina
Conclusión
Referencias bibliográficas

NOTA: Toda la información que se brinda en este artículo es de carácter investigativo y con fines académicos y de actualización para estudiantes y profesionales de la salud. En ningún caso es de carácter general ni sustituye el asesoramiento de un médico. Ante cualquier duda que pueda tener sobre su estado de salud, consulte con su médico o especialista.





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