Agosto-Octubre 2000 5
ISSN 1317-987X
 
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Artículos
 



Neurociencia
Transducina: La proteína G del proceso de excitación visual

Modificación química de las cisteínas de la transducina

El marcaje químico de aminoácidos es una aproximación muy útil para realizar estudios de la relación entre la estructura y la función en proteínas. Aunque varios tipos de residuos pueden ser derivatizados químicamente, los residuos de cisteína se distinguen por su alta y específica reactividad.

El papel de los grupos sulfhídricos de la transducina fue examinado por modificación química con cinco diferentes reactivos: 4-vinilo piridina (VP); ácido 4-acetamido-4?-maleimidilo-estilbeno-2,2?disulfonico (AMDA); 2,5-dimetoxiestilbeno-4?-maleimida (DM): ácido 2-nitro 5-tiocianobenzoico (NTCBA), y IAA, los cuales poseen diferentes tamaños y propiedades iónicas. AMDA, NTCBA, y IAA son compuestos hidrofílicos, mientras que DM y VP son hidrofóbicos. Además, AMDA y DM son más voluminosos que VP, IAA, y NTCBA.

La incubación de transducina con estos compuestos conllevó a una inactivación casi inmediata de la actividad enlazadora de nucleótidos de guanina de la transducina. En todos los casos, agentes reductores como b -mercaptoetanol o ditiotreitol, protegieron de forma dosis-dependiente a la transducina ante la modificación, demostrándose así la especificidad de la reacción. Además, cuando la rodopsina fue incubada con estos reactivos, no se observó ningún efecto sobre su capacidad de catalizar el intercambio de nucleótidos de la transducina por efecto de la luz, comprobándose que el efecto observado estaba produciéndose sobre la transducina y no sobre la rodopsina.

Figura 10. Efectos de los reactivos modificadores de grupos sulfhídricos sobre las actividades enlazadoras de rodopsina y nucleótidos de guanina de la transducina. La figura resume los puntos específicos donde AMDA, VP, NTCBA y IAA afectan las interacciones funcionales de la transducina. Panel A: Estructura de la transducina (Tabg) enlazada a GDP (Lambright et al., 1996). Panel B: Interacciones de la transducina con la rodopsina fotoactivada (R*) y con la bicapa lipídica de la membrana (Hamm, 1998). La posición y orientación de las siete hélices a de la rodopsina se basa en su estructura de difracción electrónica de baja resolución (Unger et al.,1997; Baldwin et al., 1997). Los grupos acilos sobre rodopsina, Ta y Tg se muestran interactuando con la membrana. La modificación de transducina con AMDA, o con VP, inhibe específicamente su interacción con R*. Panel C: R* cataliza el intercambio de GDP por GTP sobre Ta, lo que causa la disociación de Ta-GTP del complejo Tbg. La transducina tratada con NTCBA, o con IAA, puede enlazarse físicamente a R*. Sin embargo, la reacción de intercambio de nucleótidos es abolida, y la proteína modificada permanece asociada a R* aún en presencia de GTP. VP inactivó el enlazamiento de nucleótidos de guanina, y la subsecuente disociación de la transducina, aún cuando el complejo entre R* y la transducina (R*:Tabg) fue formado previo a la reacción de modificación (Panel D ® C). Por el contrario, R* fue capaz de proteger contra la inactivación de la transducina, cuando AMDA, NTCBA, o IAA fueron utilizados en complejos R*:Tabg preformados.

Como se muestra en la figura 10, con el uso de reactivos modificadores de grupos sulfhídricos, hemos podido fijar varias formas conformacionales de la transducina que ocurren en diferentes etapas de su ciclo de activación, suministrando así condiciones para estudiar dos de los pasos iniciales del proceso visual: el enlazamiento de la transducina a la rodopsina, dependiente de la luz, y la reacción de intercambio de nucleótidos de guanina de la transducina. Brevemente, experimentos de sedimentación seguidos por electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS y Western blots mostraron que:

  1. La modificación de transducina con AMDA, o con VP, abolió el enlazamiento de la transducina a la rodopsina fotoexcitada.
  2. El marcaje de transducina con NTCBA, o con IAA, permitió esta interacción, pero afectó la actividad enlazadora de nucleótidos de guanina de la proteína, dependiente de la luz.
  3. El tratamiento de la transducina con DM produjo la precipitación de la proteína, probablemente por efecto de la alta hidrofobicidad del reactivo.

Ensayos similares de modificación de complejos transducina:R* mostraron que la actividad enlazadora de nucleótidos de guanina se mantuvo bajo los tratamientos con AMDA, NTCBA, y IAA, pero no así bajo los tratamientos con VP o DM. Esto sugirió que la rodopsina fotoactivada fue capaz de proteger contra la inhibición producida por AMDA, NTCBA, y IAA sobre la función de la transducina, pero no en contra de la inactivación causada por VP o DM.

Separaciones por HPLC de las digestiones trípticas de transducina modificada con AMDA mostraron un péptido principal marcado con dicho reactivo. En contraste, VP modificó al menos cuatro diferentes péptidos en transducina. Dado que el marcaje diferencial de los grupos tioles de la transducina altera las actividades enlazadoras de rodopsina y nucleótidos de guanina de dicha proteína, estos resultados sugieren la existencia de diferentes cisteínas funcionales sobre la transducina que están localizadas próximas al sitio de interacción con la proteína fotorreceptora, cerca del sitio de enlazamiento del nucleótido de guanina, o en regiones involucradas en los cambios conformacionales que ocurren durante la activación de la transducina.

La modificación de transducina con IAA fue estudiada más a fondo empleando [3H] IAA. La estequiometría de la alquilación fue determinada por filtración a través de papeles de nitrocelulosa, obteniéndose un valor de alrededor de 1 mol de IAA incorporado por mol de holoenzima. A fin de identificar la cisteína modificada, la transducina fue incubada con [3H] IAA en una escala preparativa, y fue luego digerida con tripsina. Cuando los péptidos resultantes se resolvieron por HPLC, se identificó un pico principal marcado radiactivamente. Este péptido fue sujeto a secuenciación de fase gaseosa y correspondió a los residuos 342-350 de la subunidad a de la transducina, o sea, al péptido tríptico COOH-terminal de Ta . La radioactividad fue liberada en el ciclo 6 de la secuenciación, lo que identificó al residuo derivatizado con IAA como la Cys347 de Ta . Tomando como base los resultados de protección por R* previamente obtenidos, la Cys347 de Ta debe entonces estar localizada en la proximidad del sitio de contacto entre la transducina y la rodopsina. En coincidencia con los resultados obtenidos, un número considerable de evidencias de otros laboratorios ha implicado al COOH-terminal de Ta , que es la región en la cual está localizada esta cisteína, con la interacción de la transducina con la rodopsina. Sin embargo, otras regiones más allá de la cola C-terminal de Ta también están involucradas, y Tb g también parece interactuar físicamente con la rodopsina.

La subunidad Ta aislada, en estado nativo, también fue tratada con [3H] IAA en una escala preparativa. Cuando la subunidad marcada con IAA fue digerida con tripsina y separada cromatográficamente por HPLC, dos picos radioactivos principales fueron obtenidos. Uno de los picos correspondió al péptido tríptico COOH-terminal de Ta , identificando a la Cys347 como una de las cisteínas derivatizadas por IAA en Ta . El segundo péptido tríptico correspondió a los residuos 129-138, identificando a la Cys135 en el ciclo 7 de secuenciación, como el otro sitio modificado por IAA en Ta . Claramente, el ambiente alrededor del residuo 135 debe estar ligeramente alterado en Ta , al compararse con transducina, ya que esta cisteína no es alquilada en el heterotrímero. Posiblemente el dímero b g previene estéricamente la derivatización de la Cys135 en la transducina nativa.

Como se mencionó arriba, muestras de transducina modificadas con IAA, o NTCBA, fueron capaces de interactuar fuertemente con la rodopsina fotoexcitada. Sin embargo, esta asociación no se rompió en presencia de GTP. Esto podría ser explicado de dos posibles maneras: 1) que el GDP no pueda salir del bolsillo de enlazamiento del nucleótido de guanina, o 2) que el GTP no pueda entrar a dicho bolsillo durante la reacción de intercambio del nucleótido. A fin de conseguir la explicación a nuestras observaciones experimentales, se llevaron a cabo ensayos para medir la liberación de GDP a partir de transducina previamente cargada con [a -32P] GDP. Aunque la transducina modificada con IAA falló en la toma del nucleótido de guanina trifosfatado, la transducina carboximetilada fue capaz de liberar GDP cuando se incubó con rodopsina fotoexcitada (Fig. 11). Por ello, usando transducina marcada con IAA, hemos sido capaces de estabilizar un complejo intermediario entre la transducina y la rodopsina que debe tener la conformación de la transducina con el bolsillo del nucleótido vacío. En contraste, la liberación de GDP de la transducina modificada con NTCBA fue completamente nula, lo que insinúa que la transducina modificada con NTCBA pareciera estar estructuralmente bloqueada en su estado inactivo, enlazado a GDP, aún en presencia de rodopsina fotoexcitada (Fig. 11). Con el uso de estos reactivos, hemos podido entonces estabilizar dos formas conformacionales de la transducina que ocurren en diferentes etapas de su ciclo de activación, y que están directamente involucradas en la reacción de intercambio de nucleótidos de guanina de la transducina.

Figura 11. Efecto de la modificación de transducina con NTCBA, o con IAA, sobre su interacción con los nucleótidos de guanina. Aunque la transducina modificada con NTCBA, o con IAA, puede interaccionar con la rodopsina en presencia de luz, su capacidad de enlazar nucleótidos de guanina trifosfatados está completamente inhibida. Como se ilustra en la figura, la proteína modificada con NTCBA es incapaz de liberar GDP de su bolsillo de enlazamiento de nucleótidos. Por el contrario, la transducina carboximetilada con IAA puede liberar GDP de dicho bolsillo, pero no es capaz de tomar GTP de vuelta.

Las estructuras de rayos X de las diferentes formas de Ta no muestran el plegamiento de la región C-terminal, donde la Cys347 está localizada, debido a que esta región está desordenada y no está visible en las estructuras resueltas. Sin embargo, la estructura tridimensional del undecapéptido C-terminal de Ta fue determinada por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), mientras el mismo estaba enlazado a la rodopsina iluminada. Al superponer la estructura de RMN de este péptido con la estructura cristalina de rayos X de Ta b g enlazada a GDP, a través de cuatro residuos compartidos en ambas estructuras (residuos 340-343), se construyó el modelo que se muestra en la figura 9. En dicha figura puede notarse la localización de la Cys347 (verde), que es el residuo modificado por IAA tanto en la holoenzima como en la subunidad a aislada, y de la Cys135 (amarillo), el otro residuo modificado por IAA en Ta . La figura también muestra la obvia orientación y proximidad de la Cys347 hacia la localización hipotética de la membrana (línea blanca), indicando que se encuentra situada en la superficie de la transducina que interactúa con la rodopsina.

El proceso visual y su cascada de señalización
Estructura de la transducina
Sitios de Interacción en el complejo Tb g
Modificación química de las cisteínas de la transducina
Requerimientos de lípidos en la función de la rodopsina
Conclusión
Referencias bibliográficas

NOTA: Toda la información que se brinda en este artículo es de carácter investigativo y con fines académicos y de actualización para estudiantes y profesionales de la salud. En ningún caso es de carácter general ni sustituye el asesoramiento de un médico. Ante cualquier duda que pueda tener sobre su estado de salud, consulte con su médico o especialista.





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