Microbiología Evaluación de Medios de Cultivo para Mycoplasma pneumoniae.
Introducción
Los micoplasmas son las
bacterias de vida libre más pequeñas capaces de crecer en medios de cultivo
libres de células. Pertenecen a la Clase Mollicutes,
Orden Mycoplasmatales, Familia Mycoplasmataceae y Género Micoplasma. Este último incluye más de 100 especies, las cuales se
caracterizan por carecer de pared celular y ser pleomórficas. Poseen una
membrana de tres capas que contiene esteroles que les confiere soporte
estructural. La mayoría de los micoplasmas son anaerobios facultativos y su
energía la obtienen principalmente a través del metabolismo de carbohidratos
(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).En el ser
humano se han aislado 13 especies de micoplasmas, entre las cuales se destaca Mycoplasma pneumoniae. Este microorganismo
se caracteriza por tener forma de bastón, mide aproximadamente 10 x 20 nm, y
presenta en un extremo una organela responsable de su unión a las membranas
celulares. Clínicamente produce infecciones del tracto respiratorio,
generalmente en forma de neumonía de la comunidad o infecciones del tracto
respiratorio alto. Se le atribuye la causa de aproximadamente el 20% de las
neumonías adquiridas en la comunidad (NAC) en la población general y el 50% de
las neumonías en personas en condiciones de hacinamiento. Las infecciones
extrapulmonares ocurren con menor frecuencia pero pueden ser más graves:
producen infección localizada en sistema nervioso central, piel, articulaciones
y otros. Estas últimas, generalmente se acompañan de un cuadro respiratorio, pero
pueden aparecer en ausencia absoluta de síntomas en estas localizaciones (3, 6,
7, 9).Debido a la importancia de M. pneumoniae
como agente causal de las NAC, se hace necesario disponer de un método
diagnóstico que sea sensible y específico para aplicar el tratamiento apropiado
a los pacientes y disminuir la morbilidad.El cultivo y aislamiento de micoplasmas y más específicamente de M.
pneumoniae representa un importante reto para el laboratorio, ya que este
microorganismo posee características muy particulares, siendo exigentes desde el
punto de vista nutricional y sensible a variaciones de pH, temperatura y
presión osmótica. Por lo tanto se deben garantizar condiciones óptimas para su
desarrollo en medios de cultivo para mantener o aislar cepas (7, 8, 9).El cultivo de micoplasmas patógenos para
humanos requiere de un medio de cultivo base enriquecido con peptona, extracto
de levadura y suero, todo esto suplementado con un sustrato metabólico (generalmente
glucosa). Adicionalmente, se utilizan indicadores de pH como el rojo de fenol
para poder detectar el crecimiento del microorganismo, ya que usualmente no
producen turbidez en medio de cultivos líquidos debido a su pequeño tamaño.
Para recuperar M. pneumoniae a partir
de muestras clínicas, especialmente en muestras tomadas de sitios no estériles,
además de los componentes del cultivo antes mencionados, se requiere de
antibióticos como Penicilina G o una penicilina semi-sintética de amplio
espectro a fin de minimizar el sobrecrecimiento bacteriano. En ocasiones
también se emplea el acetato de talio para inhibir el crecimiento de otras
bacterias ya que los micoplasmas son resistentes a su acción a concentración de
1:10.000 partes en el medio de cultivo, y azul de metileno que inhibe el
crecimiento de otros micoplasmas, de modo que el medio resulta selectivo para M. pneumoniae (3, 7, 10).Entre los medios de cultivo más utilizados se
destaca el Caldo y el agar SP4 (pH 7,5) el cual fue formulado originalmente
para el cultivo de espiroplasma y es considerado el mejor medio de uso general.
Otros medios incluyen el Medio de New York City modificado, el Sistema
Trifásico (Mycotrim RS, Irvine Scientific, Irvine, Calif.), y el agar y caldo
PPLO (pleuroneumonia like organism)
con extracto de levadura y suero de caballo (2, 7).También se recomienda el uso de medios
bifásicos, en donde los tubos contienen una fase sólida de agar y una fase
líquida o caldo con una composición similar al agar,ya que se ha observado que estos medios aumentan
la recuperación de los micoplasmas en comparación con los medios de cultivos
sólidos (3, 7, 11). En general, los
medios de cultivo para M. pneumoniae
deben incubarse a 37ºC,
durante un período de tiempo máximo de 4 semanas, el tiempo para observar
crecimiento va a depender de la cantidad de bacterias presentes en el inoculo
inicial. En el caso de los medios en caldo se considera que una turbidez
macroscópica y un cambio ácido o alcalino del indicador en 1-5 días se deben a
contaminación bacteriana, por el contrario, un cambio gradual y leve del
indicador del pH en 8-15 días, sin turbidez macroscópica sugiere un cultivo
verdaderamente positivo. Cuando los cambios de color son evidentes, el caldo
debe subcultivarse rápidamente en un medio apropiado con agar, ya que a medida
que se acumula más ácido los micoplasmas rápidamente se tornan no viables. Si
no hay cambio de color obvio después de 1 y 3 semanas de incubación en el medio
bifásico, debe realizarse un subcultivo a ciegas en medios de agar (3, 7).Debido al pequeño tamaño del M. pneumoniae, sus colonias no pueden
ser visualizadas en los medios de agar a simple vista, solo mediante el uso de
un microscopio estereoscópico (objetivo de 20X o 60X) observándose redondas con
superficie granulosa y sumergidas en el agar. Es importante resaltar que el M. pneumoniae puede mostrar o no esta
apariencia característica y además se debe ser cuidadoso en diferenciar esta
morfología de artefactos tales como burbujas de aire, agua o gotas lípidos los
cuales pueden causar confusión (3, 7).Con
todo lo anteriormente mencionado, se destaca la complejidad que implica el uso
de medios de cultivo para el aislamiento o crecimiento de M. pneumoniae, más aún si su preparación se realiza de manera
casera, debido a la variedad de suplementos e inhibidores. Esto se contrapone
con el costo, el cual se incrementa si dichos suplementos son adquiridos de
manera comercial. Adicional a esto, el tiempo de crecimiento del microorganismo
también es una desventaja, que impide realizar un diagnóstico rápido o en la
fase aguda de la enfermedad. Se debe disponer además de un personal con
experiencia para la observación de las colonias microscópicas, por tanto, su implementación
en los laboratorios de rutina no es sencilla. Es por ello que en el entorno
clínico clínica se emplea para el diagnóstico de M. pneumoniae como agente causal de NAC, de manera muy frecuente la
serología. Esta técnica requiere la toma de dos muestras de suero en períodos
de tiempo distintos, por lo que tampoco se obtiene un diagnóstico rápido, y en
consecuencia el tratamiento se realiza de manera empírica, y a lo largo del
tiempo puede en consecuencia seleccionar cepas resistentes. Es importante destacar que en la
actualidad en Venezuela no se está realizando cultivo para M. pneumoniae y es de nuestro interés en la Sección de Bacteriología
del Instituto de Medicina Tropical (IMT), conocer las ventajas y desventajas
que ofrecen los medios de cultivo con la finalidad de utilizarlos como apoyo en
el mantenimiento de cepas para que en posteriores estudios nos permita
estandarizar y desarrollar técnicas de diagnóstico rápido como la PCR para la detección de M. pneumoniae como agente causal de
infecciones respiratorias.
NOTA:Toda la información que se brinda en este artículo es de carácter investigativo y con fines académicos y de actualización para estudiantes y profesionales de la salud. En ningún caso es de carácter general ni sustituye el asesoramiento de un médico. Ante cualquier duda que pueda tener sobre su estado de salud, consulte con su médico o especialista.
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