La epidemiología del dengue en América se ha modificado, debido a las frecuentes epidemias de la enfermedad en la zona del Caribe durante los últimos 15 años10. En 1981, el virus del dengue tipo II produjo en Cuba una epidemia donde se diagnosticaron 344.203 casos y con 158 muertes certificadas constituyéndose, en el mayor brote de dengue hemorrágico en el continente americano descrito hasta el momento 11,12,13.

La segunda epidemia del dengue en América después de la cubana, fue en Yucatán, México en 1984, donde se describieron 5486 casos14. Posteriormente, en 1990, se produjo en Venezuela otra epidemia con 3108 casos informados y 73 defunciones15. La falta de medidas de prevención eficaces, especialmente en la lucha por la erradicación de los mosquitos asociados a otras condiciones desfavorables, hacen predecir que se producirán más epidemias de dengue hemorrágico en América.

En Venezuela para el año 1991, se había descrito 4187 casos correspondientes a dengue clásico y 1048 casos de dengue hemorrágico16. La mortalidad en los casos de dengue hemorrágico bajo tratamiento médico, osciló alrededor del 1-3%, mientras que casos sin tratamiento llegó al 50%17. En la actualidad estamos viendo que existen grandes extensiones del país donde el dengue es hiperendémico y estamos viviendo desde 1998 brotes de Dengue hemorrágico. En 1998 se describieron 37.553 casos y 33 defunciones18; para 1999 hubo 26.716 casos con 15 defunciones17; en el año 2000, 21.101 se señalaron casos con 5 muertes y para el año 2001, 83.180 nuevos casos con 15 defunciones19. En el primer trimestre del año 2002 existían 15.166 casos sin muertes20.

Desde 1944, se había detectado dos tipos de virus inmunológicamente distintos, Dengue – 1 y Dengue – 221,22, mientras que Hammon y col. 1956, citados por Hayos y Gubler23, aislaron dos nuevos serotipos, designados como Dengue 3 y Dengue 4.

Según Cáceres 17, la primera mención del dengue en Venezuela data de 1828, cuando el Dr. José María Vargas escribió un informe “Memoria”, en colaboración con los doctores Cabrera y González sobre una epidemia que azotó a Caracas. La segunda publicación, es de F.A. Risquez hecha en Caracas, en el año 1890 y posteriormente aparecieron esporádicamente comunicaciones sobre la clínica y la epidemiología de esta enfermedad.

Bancroft (1906), publicó la primera prueba de que el mosquito Aedes aegypti era el vector de la enfermedad, lo que se confirmó definitivamente por Cleland y col. (1919); Silar y col. (1926) y por Simmons y col. (1931); los mismos autores confirmaron que el Aedes albopictus es también el vector del dengue24. El mosquito hembra (Aedes aegypti), es el vector de la infección, al alimentarse con la sangre que toma al picar a la persona infectada; después de un período de tiempo variable, de 8 a 10 horas, el virus se establece en las glándulas salivares del mosquito, desde donde va a ser transmitido a través de la saliva a otro humano susceptible. No existen lesiones características de la infección y aunque ésta pueda diseminarse a varios órganos, el virus muestra un tropismo marcado por el sistema monocito – macrofágico25.

En estudios realizados con el microscopio electrónico de transmisión en células cultivadas, los virus del dengue se observaron como partículas esféricas de 40 – 50nm de diámetro, poseen una envoltura de lípidos y glicoproteínas con proyecciones en forma de tornillo y un compartimiento central ligeramente hexagonal de 40nm de diámetro25. El ácido ribonucléico es de cadena lineal sencilla, protegido por una proteína capsídica (PE2), la ribonucleoproteína, se encuentra en el compartimiento central de la partícula viral y constituye el nucleocápside viral. El virus presenta también otras dos proteínas estructurales distribuidas en su envoltura externa, una conocida como E (PE3), con peso molecular de 59.000d., y la otra identificada como M (PE1), con peso molecular de 7.700d., que se hallan combinadas a cadenas de carbohidratos. El genoma codifica 5 proteínas no estructurales (PNE), cuyas funciones son aún desconocidas.

Desde el punto de vista ultraestructural, es evidente la similitud del virus del dengue con otros Togavirus como encefalitis equina venezolana (EEV) 26, 27, 28, 29. Las propiedades hemoaglutinantes del virus están determinadas por la proteína estructural (PE3), que se combina con carbohidratos formando una glicoproteina (GP) incorporada en la envoltura externa del virus, y es la responsable de la prueba de hemaglutinación de los glóbulos rojos. Los elementos proteicos y glicoproteicos del virus del dengue, constituyen su estructura antigénica y son los que han permitido la clasificación de este grupo viral dentro de la familia Togaviridae, grupo flavivirus y en los serotipos dengue 1, 2, 3 y 430.

El virus del dengue fue aislado en 86 casos (94.5%) de la sangre periférica de 90 pacientes con la enfermedad, y en ese estudio, sólo en 28 casos (31.5%), los virus se obtuvieron del plasma; es de notar que el 84% de los virus aislados provenían de las muestras tomadas mientras el paciente presentaba fiebre31. Este hecho es comparable con los resultados obtenidos en nuestro estudio en donde logramos detectar ultraestructuralmente, la presencia del virus sólo cuando el paciente se encontraba febril, lo que es equivalente a la fase de viremia. Es importante mencionar que el aislamiento del virus es más fácil cuando el paciente se encuentra en viremia, lo que sugiere la existencia de una subpoblación de leucocitos en sangre periférica que está infectada. Así mismo, el aislamiento del virus fue menos frecuente después del quinto día de la enfermedad y se ha descrito que no existe relación alguna entre el aislamiento del virus, la edad o el sexo del paciente31. Las células infectadas en varias preparaciones nuestras, revelaron ser en su mayoría, monolitos, como se ha descrito 31. Este hecho nos sugirió la posibilidad de detectar el virus del dengue de los leucocitos circulantes en pacientes infectados. Estudios realizados con el virus de Chinkungunya, el virus de la Rubéola y el virus de la Encefalitis Equina Venezolana, ha demostrado hallazgos similares a los señalados sobre el virus del dengue, lo cual sugiere que la invasión del virus a los leucocitos puede presentarse en otras infecciones por Togavirus 26,29,32.

La evidencia de que el monocito puede ser la mayor fuente de invasión para el aislamiento del virus del dengue, está apoyada por los hallazgos de varios autores 32,33,34,35,36, en pacientes infectados con el virus del dengue y experimentalmente con otros Togavirus29. En este estudio, logramos detectar las partículas virales en los monolitos, circulantes en la sangre periférica de los pacientes infectados por el virus del dengue. Este hecho en humanos le da apoyo a las observaciones de que en el dengue los monocitos son las células más importantes para la replicación viral.

Si se acepta que las células del sistema fagocítico – mononuclear es el sitio de la replicación del virus del dengue, habría que señalar como en estudios previos se demostró, que la infección con virus de dengue podía aparecer en megacariocitos de la médula ósea37. Los antígenos virales también se han detectado en monocitos localizados en riñón, piel, hígado, bazo, timo, pulmones, en estos casos, el virus del dengue se aisló, tanto de leucocitos de sangre periférica, como de los tejidos de autopsias, entre ellos, de ganglios linfáticos y de la médula ósea38. Se ha señalado que el virus del dengue puede ser obtenido de plaquetas bien lavadas o directamente desde el plasma, pero esto es un hallazgo poco común39. En los casos estudiados en este trabajo, no logramos identificar el virus dentro de las plaquetas. Los estudios con técnicas de inmunofluorescencia también han demostrado cómo los antígenos del virus pueden detectarse en leucocitos de pacientes infectados34. El virus también se aisló de leucocitos en la sangre periférica en monos infectados experimentalmente38. Poco se conoce sobre los eventos moleculares, en los que resulta infectado un fagocito mononuclear antes de la replicación del virus.

El virus del dengue tipo I se ha reproducido en cultivos de células de promonocitos humanos, identificado por inmunofluorescencia y hemaglutinación32, y posteriormente por microscopía electrónica 36. Algunos investigadores han demostrado la presencia de linfocitos grandes y atípicos en la sangre periférica de pacientes infectados por el virus del dengue 31, 40. Los cambios atípicos en los linfocitos pueden ser considerados como progresión de la enfermedad, y ser utilizados como marcadores de actividad de la enfermedad40. En nuestra investigación, la presencia de linfocitos atípicos fue casi una constante, ya que estos se encontraron en la mayoría de los pacientes. Hallazgos similares, con vacuolización citoplasmática, se detectaron desde hace años en otras infecciones por Togavirus en humanos 41, 42, 43, y en animales inoculados experimentalmente44. El significado de estas atipias y vacuolizaciones en los leucocitos de la sangre periférica aún permanecen inciertos. En realidad, muchas de estas células tienen características de linfoblastos.

Los linfocitos atípicos en el dengue aparecen como células con abundante citoplasma intensamente basofílico que, semeja a células plasmáticas. El inmunofenotipo demostró, que la composición de los linfocitos atípicos tiene un origen predominante de linfocitos T, los cuales pueden ser responsables de la producción de interferon, y constituye el reflejo directo de la actividad del proceso inmune presente en la infección con dengue35, 40. Los linfocitos atípicos también podrían ser linfocitos B diferenciados o células plasmáticas productoras de inmunoglobulinas demostradas morfológicamente por la presencia de estas células en la sangre periférica; estas posibilidades deberían ser examinadas en detalle.

Algunos estudios realizados con el microscopio electrónico, indican que el virus del dengue entra a la célula por la vía de endocitosis, un fenómeno que ha sido descrito con otros Togavirus45,46. El mecanismo de penetración y la ruta de entrada de los flavivirus en las células, ha sido demostrado con el virus Western Nile (WNV) en macrófagos, utilizando el microscopio electrónico y con la ayuda de un anticuerpo monoclonal F6/16ª. La importancia de las vesículas cubiertas que se ven después de aumentar la temperatura de las células a 37ºC, no descarta la posibilidad de que grupos de partículas virales puedan ser englobadas por un proceso similar a la fagocitosis ejercida por los macrófagos; no obstante haberse demostrado estos hallazgos, que sugieren una vía lisosomal, no fue posible demostrar una positividad para la fosfatasa ácida, evidencia que fue interpretada como una fase prelisosómica para explicar el comportamiento celular implicado en la adherencia y penetración del virus WNV en macrófagos cultivados47.

Con el microscopio electrónico, el estudio de la zona perinuclear de las células infectadas con el virus dengue – 2, ha mostrado cuerpos vesiculares que contienen numerosas partículas virales electróndensas de 45 – 50nm localizadas libres dentro de las cisternas del retículo endoplasmático liso y rugoso, y en la cisterna perinuclear48. No se logró establecer relación alguna entre las partículas virales y el aparato de Golgi, ni evidenciar la presencia de partículas virales libres en el citoplasma o dentro del retículo endoplasmático rugoso, ni tampoco en el espacio extracelular. La síntesis de macromoléculas del virus del dengue indicada por antígenos no estructurales y los cuerpos vesiculares, se ha ubicado en la membrana del retículo endoplasmático rugoso; en los monocitos de la sangre periférica en el presente estudio, no pudimos demostrar alguna relación entre las partículas virales y el retículo endoplasmático rugoso.

Estudios previos de la sangre periférica de pacientes infectados con virus ARN, específicamente en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana, han mostrado estructuras túbuloreticulares (TRS) en las células mononucleares de la sangre periférica 49,50 . Hallazgos de investigaciones hechas en el Instituto Anatomopatológico de la Universidad Central de Venezuela, demostraron estructuras túbuloreticulares en sangre periférica de pacientes con dengue51. Las estructuras túbuloreticulares han sido descritas en otras entidades patológicas 52,53,54,55 . De la misma manera en esta investigación logramos identificar estructuras túbuloreticulares como túbulos anastomosados de 24nm de diámetro en el citoplasma de linfocitos y monocitos, dentro de las cisternas del retículo endoplasmático rugoso. La presencia de TRS en los monocitos de los enfermos con dengue, está relacionada con altos niveles de Interferon alfa producido por las mismas células mononucleares durante la infección35, una situación similar a la observada en otras infecciones virales. Watanabe y col 56, demostraron que las TRS en las células mononucleares de la sangre periférica en la hepatitis C crónica tratados con Interferon alfa, y también detectaron cisternas cilíndricas confrontadas en las mismas células.

Nuestros hallazgos ultraestructurales, señalan la presencia de linfocitos citotóxicos naturales característicos en la sangre periférica de los pacientes infectados con el virus del dengue. Según Kurane y Ennis35, la presencia de estas células citotóxicas, puede ser uno de los mecanismos de la respuesta inmune, responsable del control de la infección viral. Recientemente, se señaló que los linfocitos T citotóxicos son activados durante la infección con el virus del dengue, y es posible que estas células T virus específicas, contribuyan en la patogénesis del dengue hemorrágico y en el síndrome del choque del dengue, dado por una producción de Interferon alfa y lisis de células infectadas durante la infección viral57. Algunos de estos hallazgos ultraestructurales, plantean interrogantes para ser examinados detalladamente en el futuro cercano. Esperamos que trabajos de investigación puedan dilucidar quizá inmuhistoquimicamente en la sangre o en los tejidos de humanos, las alteraciones que se producen durante la infección con el virus del Dengue.