Anatomía Patológica
Expresión Inmunohistoquímica del Antígeno Ki-67 en Relación con el Grado Histológico y Riesgo de Recidivas en Meningiomas Intracraneanos
Población y métodos
Entre los años 1.980 a 2.003, se registraron en la Sección
de Neuropatología del Instituto Anatomopatológico “Dr. José A. O´Daly” de la
Universidad Central de Venezuela (IAP-UCV) un total de 580 meningiomas
pertenecientes a 532 pacientes, de los cuales 455 tumores correspondieron a
meningiomas no recidivantes (455 pacientes), 110 a meningiomas recidivantes (67
pacientes) y 15 a meningiomas múltiples (10 pacientes). Todos estos casos
fueron revisados clínica e histológicamente antes de la selección de la muestra
del estudio.
De las historias clínicas y/o solicitudes de biopsia
fueron anotados los datos de identificación de cada paciente, edad para el
momento de la primera cirugía, sexo, presentación clínica, localización del
tumor, extensión de la resección quirúrgica macroscópica inicial
(total/parcial), número e intervalo de recidivas, tiempo de seguimiento clínico
post-operatorio y antecedentes personales y/o familiares de importancia. La
supervivencia libre de recidivas fue definida como el intervalo de tiempo (en
meses) transcurrido desde la fecha del tratamiento quirúrgico inicial hasta la
fecha del último control médico para el caso de los meningiomas no recidivantes
o hasta la fecha de la subsecuente intervención quirúrgica en caso de
meningiomas recidivantes. Cuando presentes, se anotaron también el intervalo de
aparición de metástasis y la fecha de muerte del paciente, registrando además
la causa del fallecimiento.
Los bloques de parafina con tejido tumoral incluido y las
láminas histológicas correspondientes, teñidas con hematoxilina y eosina y
demás coloraciones especiales, tanto del tumor inicial como de las recidivas,
fueron revisadas histológicamente. Se anotaron en cada caso el tipo histológico
predominante del tumor (según el esquema de clasificación de la OMS), el
índice mitótico (recuento de mitosis en 10 campos microscópicos consecutivos de
400x) y la presencia/ausencia de hipercelularidad, células pequeñas,
crecimiento en láminas, macronucléolos, necrosis, pérdida de diferenciación
meningotelial e invasión al parénquima nervioso y/o de otras estructuras
adyacentes al tumor.
Los meningiomas fueron clasificados en tres grados
histológicos (I, II y III) siguiendo el esquema de la OMS (7)
y las recomendaciones de Perry y col. (4). Se catalogaron
como meningiomas benignos (grado I) los subtipos meningotelial, fibroblástico,
transicional, psammomatoso, angiomatoso, microquístico, secretor,
linfoplasmocitario y metaplásico que no presentaron características
histopatológicas de atipicidad o malignidad (7). Fueron considerados
meningiomas atípicos (grado II) aquellos tumores que cumplieron con cualquiera
de los siguientes criterios histopatológicos: 1) actividad mitótica ³ 4
mitosis en 10 campos microscópicos de 400x; 2) presencia de al menos tres de
las siguientes características: incremento de celularidad, células pequeñas con
aumento de relación núcleo/citoplasma, nucleólos prominentes y crecimiento en
láminas; o, 3) invasión del parénquima nervioso (4,7). Como
meningiomas malignos o anaplásicos (grado III) fueron clasificados aquellos
tumores que llenaron cualquiera de los siguientes criterios histopatológicos:
1) elevada actividad mitótica ³ 20 mitosis en 10 campos microscópicos de 400x); o, 2) citología
obviamente maligna con pérdida de la diferenciación meningotelial (tumor
parecido a sarcoma, carcinoma o melanoma), bien sea de manera focal o difusa (4,7).
En el grado II también fueron incluidos los meningiomas de células claras y
cordoide, mientras que el grado III abarcó además a los meningiomas rabdoide y
papilar (4,7). Aquellos meningiomas de difícil reconocimiento
histopatológico (especialmente tumores indiferenciados de alto grado
histológico) fueron diagnosticados y clasificados como tales si presentaban
diferenciación meningotelial en una biopsia previa o atributos de meningiomas
desde el punto de vista inmunohistoquímico y/o ultraestructural.
El estudio inmunohistoquímico del antígeno Ki-67 fue
realizado en los casos que cumplieron con los siguientes criterios de
inclusión: 1) edad igual o mayor de 20 años; 2) localización intracraneana del
tumor; 3) información clínica completa; 4) resección quirúrgica macroscópica
inicial equivalente a 100% del tumor; 5) tiempo de seguimiento clínico post-operatorio
no menor de 5 años para los meningiomas no recidivantes o información
disponible acerca de las intervenciones quirúrgicas subsecuentes en caso de
meningiomas recidivantes; y, 6) material histológico disponible de buena
calidad representativo del tumor inicialmente resecado.
Luego de la exclusión de los pacientes con meningiomas
múltiples y de la aplicación de los criterios de inclusión en los pacientes
restantes, un total de 46 casos fueron seleccionados para la comparación de los
IM del antígeno Ki-67 entre meningiomas no recidivantes (n = 23) y
recidivantes (n = 23). En el primer grupo se incluyeron 11 meningiomas
transicionales, 2 meningoteliales, 2 fibroblásticos, 3 microquísticos, 2
secretores, 1 metaplásico (xantomatoso) y 2 atípicos. El grupo de tumores
recidivantes estuvo conformado por 13 meningiomas transicionales, 2
meningoteliales, 2 fibroblásticos, 1 microquístico, 1 metaplásico
(xantomatoso), 2 atípicos, 1 de células claras y 1 papilar.
Mediante selección realizada al azar, se incluyeron 47
pacientes adicionales para obtener números representativos de tumores dentro de
cada grado histológico (41 meningiomas grado I, 23 grado II y 10 grado III) y
poder comparar así los IM del antígeno Ki-67 entre los diferentes grados
histológicos de los meningiomas. Dentro del grado I se incluyeron 11
meningiomas transicionales y cinco de cada uno de los siguientes subtipos:
meningotelial, fibroblástico, microquístico, angiomatoso, secretor y
metaplásico (xantomatoso). Los tumores grado II estuvieron conformados por 12
meningiomas atípicos, 9 de células claras y 2 cordoides, mientras que para el
grado III se seleccionaron 4 meningiomas malignos y 6 papilares.
Se utilizó un anticuerpo primario monoclonal de ratón (Ki-S5;
Dako, Glostrup, Dinamarca; dilución 1:25) para la detección
inmunohistoquímica del antígeno Ki-67 en los casos seleccionados. Para tal
efecto, cortes histológicos de 4 mm de espesor representativos de cada tumor fueron
montados en láminas silanizadas,
desparafinados en xilol y rehidratados con pasos sucesivos de alcoholes
de grado decreciente hasta agua desionizada. La actividad de peroxidasa
endógena y las uniones electrostáticas inespecíficas fueron bloqueadas
respectivamente con solución de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol y un
agente bloqueante de proteínas (Immunon Shandon, Pittsburg, EEUU). La
recuperación antigénica se efectuó por calor con una vaporera de marca
comercial durante 30 minutos, para lo cual se dejaron las láminas inmersas en
solución recuperadora blanco de Dako de pH 6.1. Posterior al lavado con
solución de tris buffer salino con tween 20 (TBST), las láminas fueron
colocadas en contenedores adecuados y los siguientes pasos realizados en el
aparato automático Dako AutoStainer. El anticuerpo primario fue incubado
sobre las secciones histológicas a temperatura ambiente durante una hora,
seguido de lavado con TBST. Utilizando el sistema de detección y
amplificación EnVision (Dako, Carpintería, EEUU), se aplicó un anticuerpo
secundario anti-IgG de ratón unido a un polímero de dextrano marcado con
peroxidasa de rábano blanco, con tiempo de incubación de 20 minutos a
temperatura ambiente, seguido de lavado de las láminas histológicas con TBST.
Posteriormente, se aplicó una mezcla conteniendo peróxido de hidrógeno como
substrato y el cromógeno 3,3´-diaminobencidina (sistema DynaChrome;
ThermoShandon, Pittsburg, EEUU) durante 10 minutos, seguido de lavado con
agua corriente. Finalmente, los preparados histológicos fueron contrastados con
hematoxilina de Mayer, deshidratados y cubiertos con laminillas. Se utilizó
como control positivo del método inmunohistoquímico un adenocarcinoma ductal
invasor de mama con reactividad conocida para el antígeno Ki-67, en tanto que
la omisión del anticuerpo primario sobre un corte histológico seriado de este
mismo tumor generó el respectivo control negativo.
Sólo la
inmunotinción nuclear fue considerada positiva para el antígeno Ki-67,
independientemente del grado de intensidad de la misma. El índice de marcaje
inmunohistoquímico (IM) fue expresado como el porcentaje de células
neoplásicas inmunopositivas sobre un total no menor de 3.000 células tumorales
contabilizadas en campos microscópicos consecutivos de 400x, iniciando el
recuento en aquellas áreas del tumor con mayor densidad de células
inmunoreactivas. El cálculo del IM sobre 3.000 células tumorales fue
realizado con el objeto de evitar la sobre-estimación de resultados ocasionada
por la heterogeneidad tumoral. Para el recuento celular se digitalizaron los
campos microscópicos necesarios dentro de cada tumor con el capturador de
imágenes Image-Proâ Plus version 3.0 for WindowsTM (Media
Cybernetics, L.P; Silver Spring, Maryland, EEUU). Una vez obtenidos los IM
del antígeno Ki-67 en cada uno de los casos seleccionados, se procedieron a
estimar sus valores promedios y rangos para los grupos de meningiomas
recidivantes y no recidivantes, así como para los diferentes grados
histológicos.
Todos los datos obtenidos de la investigación fueron tabulados y
analizados en base a los objetivos planteados. Las diferencias observadas en
relación con los valores promedios y rangos de los IM del antígeno Ki-67
entre meningiomas recidivantes y no recidivantes y entre los diferentes grados
histológicos fueron evaluadas mediante las pruebas estadísticas c2, prueba de probabilidad exacta de Fisher, t test no pareado y
ANOVA de una vía, utilizando para ello un intervalo de confianza de 95% y un
valor de p significativo menor de 0,05. Para tal efecto, se emplearon
los programas computarizados Microsoft Excel, EPISTAT, Graphpad Instat y Sigma
Plot. Los puntos de corte del IM del antígeno Ki-67 entre meningiomas no
recidivantes y recidivantes y entre meningiomas de diferentes grados histológicos
fueron establecidos a través del programa computarizado TG-ROC (Two-Graph
Receiver Operating Characteristic, versión 070397e for MS-Excel) (66). La
sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos
de cada punto de corte fueron estimados con un intervalo de confianza de 95%.
Finalmente, las curvas de supervivencia libres de recidivas fueron graficadas
mediante el método de Kaplan-Meier y evaluadas estadísticamente con el log-rank
test a través del programa WinSTAT for Excel (R. Fitch Software,
versión 2005.1). |