Nuestros resultados muestran que todos los agentes utilizados relajan las arterias pulmonar y aorta de la rata de una manera dosis dependiente. La mayor potencia se observa con el nitroprusiato de sodio, seguido por el vardenafil, tadalafil y sildenafil, respectivamente, tanto en las arterias pulmonar como en la aorta de la rata. Este efecto es debido a un incremento en los niveles de GMPc dentro del músculo liso vascular, lo que estimularía a una proteíncinasa dependiente de GMPc y un mayor almacenamiento de calcio en los sitios intracelulares y otros sistemas efectores ^{(19, 20, 21, 22, 23)}.

La entrada de calcio extracelular se debe principalmente a dos canales iónicos presentes en la membrana celular de las arterias: Canal de calcio operado por receptor (ROC) y canal de calcio voltaje dependiente (VOC). Al utilizar soluciones con alto potasio, se despolariza la célula y se presenta la entrada de calcio por los VOC. Al estimular con norepinefrina, dependiendo de la concentración utilizada se activan los VOC o los ROC, estos últimos al unirse el agonista a los receptores alfa 1 adrenérgicos presentes en la membrana de las células del músculo liso vascular. Esta activación conduce a la formación de trifosfato de inositol (IP₃), que se une a un receptor de IP₃ presente en la membrana del retículo sarcoplásmico, causando una contracción fásica pasajera cuando se estimula. Asímismo, la NE activa a los ROC que inducen la entrada de calcio del medio extracelular causando una contracción sostenida, tónica. Es así que cualquier agente vasodilatador a estudiar mudula los niveles intracelulares de calcio para producir su efecto relajante como mecanismo final común ⁽²⁴⁾

Con respecto al nitroprusiato de sodio (NTPNa), ha sido reportado que su efecto vasodilatador es debido, por lo menos en parte a la activación de un grupo intermediario S-nitrosotiol presente en el músculo liso vascular que incrementa la síntesis de óxido nítrico, activando a una guanilciclasa de membrana, con incremento en el GMPc. La relajación mediada por el GMPc también se relaciona con una disminución en la concentración intracelular de calcio en el músculo liso vascular inducido por el NTPNa debido a la activación de muchas proteínas por fosforilación ⁽²⁵⁾. En este punto, Bonaventura y col.⁽²⁶⁾ propusieron que en la arteria aorta de la rata estimulada con NTPNa, parte de la disminución en los niveles intracelulares de calcio luego de incrementar la concentración de este vasodilatador era debida a la activación de la NOS, ya que la L-NAME reducía el efecto del NTPNa. Ellos confirmaron estos resultados por el aumento de la concentración intraendotelial de calcio que incrementaría la expresión de la NOS y con esto el efecto relajante de los nitrovasodilatadores. Ellos destacaron que el aumento de calcio intraendotelial era debido a su entrada por la membrana y no a su salida por las organelas intracelulares y, a diferencia de lo observado por Moncada y col, ⁽²⁷⁾ quienes demostraron en aorta de rata que la relajación inducida por el NTPNa era potenciada por el endotelio vascular debido a la activación de sintasas constitutivas de óxido nítrico. Unido a esto se asocia este efecto con una activación metabólica en el músculo liso vascular por una proteína asociada a la membrana, con actividad generadora de óxido nítrico. Ferrer y col, reportaron en arteria femoral, mesentérica y aorta torácica de conejo una diferencia interarterial en cuanto a la sensibilidad al óxido nítrico. En experimentos preliminares no observamos diferencias significativas en cuanto a la respuesta vasodilatadora del NTPNa en ausencia de endotelio (datos no mostrados).

Resultados similares a los nuestros fueron reportados por Bonaventura y col. ⁽²⁶⁾ quienes en arteria aorta de rata estimulada con fenilefrina, observaron una pD₂ al nitroprusiato de sodio con el endotelio intacto de 8,92, sin observarse diferencias significativas en aquellos anillos de aorta desprovistos de endotelio. Esto difiere a lo observado por Shirasaki y Su, ⁽²⁸⁾ quienes demostraron en anillos de aorta de rata que el efecto vasodilatador del NTPNa y del nitrito de sodio no eran independientes del endotelio. Este observó un incremento en la acción relajante del nitroprusiato de sodio en ausencia de endotelio, Asímismo, Moncada y col. ⁽²⁷⁾ observaron en anillos de aorta de rata un incremento tanto en la potencia vasoconstrictora como en la tensión desarrollada cuando se utilizaba fenilefrina como contracturante. También observaron un incremento en la potencia en ausencia de endotelio en las mismas preparaciones, cuando utilizaron una concentración de NTPNa de 1 . 10^-6 M, por lo que sugirieron que esto estaba relacionado con una supersensibilidad de los nitrovasodilatadores al óxido nítrico luego de la remoción del endotelio a nivel de su sitio blanco, la guanilciclasa soluble.

El efecto inhibitorio del azul de metileno (MB) sobre el efecto relajante al NTPNa en la arteria pulmonar principal de rata es debido a que el MB inhibe selectivamente la GC soluble, siendo demostrado esto por Gruetter y col, 1981 ⁽⁴¹⁾ quienes observaron una acumulación de GMPc luego de utilizar el MB. Así mismo produce una inactivación del NO y un efecto inhibidor directo de la óxido nítrico sintasa y otras enzimas que contienen hierro ⁽⁴⁴⁾. Debido a que la relajación inducida por dadores de ON no está relacionada con la NO sintasa arterial, podemos asumir que la inhibición del MB sobre el efecto vasodilatador del NTPNa es debido a la inactivación del ON o a la inhibición de la GC, que se correspondería con nuestros resultados ya que ni en ausencia ni en presencia de endotelio se alcanzó un efecto vasodilatador del 100% cuando se incubaba las arteria pulmonar con azul de metileno.

Salom y col, 1999 ⁽⁴²⁾ observaron resultados diferentes a los nuestros en cuanto al modo de estimulación de la arteria carótida de conejo donde mostraron un mayor efecto relajante cuando estimulaban con agonistas que cuando estimulaban por despolarización, según nuestros resultados ni en la aorta ni en la pulmonar de la rata hubo diferencias significativas en cuando a la respuesta vasodilatadora cuando se estimulaba con NE o por despolarización, posiblemente estos nitrovasodilatadores como consecuencia del aumento de los niveles de GMPc, permiten independientemente de la manera de preestimular la arteria, un almacenamiento del calcio en los sitios de almacenamiento intracelular. Bolotina y col, ⁽⁴³⁾ reportaron resultados similares a los nuestros en aorta de conejo donde observaron que los nitrovasodilatadores una vez liberados, producen ralajación arterial no sólo por la estimulación de la GC, sino por una vía independiente relacionada con la activación directa de canales de K⁺, dependientes de Ca⁺² (K_Ca).

Según nuestros resultados se observa una importante diferencia en cuanto a la respuesta del sildenafil según el modo de estimulación de la arteria pulmonar principal de la rata, vasodilatando a menores concentraciones del sildenafil cuando se estimula con norepinefrina con respecto a la estimulación por despolarización. Este efecto marcado no fue observado con el NTPNa, posiblemente el sildenafil, como prototipo de los IPDE5, module los niveles intracelulares de calcio a través de los ROC, necesitándose mayores concentraciones de sildenafil para que se influya sobre la actividad de los VOC. Cuando se estimula con agonistas, se produciría una contracción fásica inicial relacionada con la liberación del calcio almacenado intracelularmente y una contracción tónica, para mantener la respuesta contráctil ⁽²⁹⁾. El hecho de observarse diferencias significativas en la respuesta al sildenafil cuando se estimula con norepinefrina puede relacionarse al hecho que este agente actúa preferentemente en la vía de señalización de calcio mediada por el trifosfato de inositol (IP₃) que se encarga de activar los mecanismos de liberación de calcio del retículo sarcoplásmico (Karaki y col, 1988) ^{(30, 31, 32)}. Güler y col, 2006 ⁽³³⁾ encontraron resultados similares a los nuestros utilizando arteria pulmonar y aorta de conejo, donde cuando estimulaban con fenilefrina (agonista alfa adrenérgico) y realizar una curva de dosis respuesta al sildenafil (1 x 10^-9 a 1 x 10^-5 M) observaban un mayor efecto relajante sobre ambas arterias, que cuando estimulaban con agonistas. Otra posible explicación del efecto observado del sildenafil cuando se estimula con agonistas pudiera relacionarse con una disminución en la entrada de calcio, lo que a su vez disminuiría la liberación de calcio inducida por calcio, aunque este efecto adicional se ha observado más con el vardenafil ⁽³⁴⁾. Nuestros resultados in vitro sugieren que el vardenafil podría ser más efectivo que el sildenafil y el tadalafil para el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar, aunque sería importante evaluar cuál fuente de calcio está principalmente involucrada en sus mecanismos vasodilatadores ⁽⁴⁵⁾

En cuanto a los inhibidores de la fosfodiesterasa 5, tadalafil, sildenafil y vardenafil, se observó una mayor potencia con este último, que pudiese estar relacionada con un efecto adicional de bloqueo de los canales de calcio voltaje dependientes. Dicha actividad fue propuesta por Toque y col, (2008) ⁽³⁵⁾ y Mochida y col, 2002 ⁽³⁶⁾ quienes demostraron en arteria pulmonar aislada de conejo que el vardenafil, a diferencia del sildenafil y el tadalafil, presentaba actividad bloqueante de los canales de calcio del plasmalema. En apoyo a esto, Corbin y col, 2004, ⁽³⁷⁾ propusieron que el vardenafil al presentar un grupo etilo en el anillo piperazina a diferencia del grupo metilo observado en el sildenafil, podría ser el responsable de las diferencias observadas. Blount y col, 2004 ⁽³⁸⁾ reportaron en una serie de ensayos la potencia y fuerza de unión de estos fármacos, donde el vardenafil además de presentar mayor potencia posee un menor rango de disociación en comparación con el tadalafil y el sildenafil. En apoyo a nuestros resultados, Texeira y col, 2006 ⁽³⁹⁾ y Sáenz y col ⁽⁴⁰⁾ utilizando arteria aorta de rata demostraron que el vardenafil era más potente en dicha preparación, siendo relativamente equipotentes el sildenafil y el vardenafil y que dicho mecanismo estaba relacionado con un incremento intracelular en los niveles de GMPc. En conclusión, los agentes vasodilatadores utilizados producen el efecto vasodilatador por la vía del óxido nítrico, con mayor efecto al estimular por despolarización, no haciendo falta la presencia del endotelio intacto para observar la respuesta, siendo el vardenafil el más potente de los agentes utilizados, posiblemente por su efecto adicional de bloqueo de los canales de calcio.