Julio-Septiembre 2018 75
ISSN 1317-987X
 
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Fisiopatología
Efecto de la Carbamilcolina y el veneno de escorpión Tityus zulianus en la secreción de proteínas de los acinos pancreáticos aislados de ratón NIH

Métodos

Obtención del TzV

Los escorpiones Tz, fueron colectados en el pueblo de Santa Cruz de Mora, y Mesa de Bolívar, Edo. Mérida, al oeste de Venezuela. Se clasificaron de acuerdo a los criterios planteados por González – Sponga (6). Los venenos fueron obtenidos por estimulación manual del telsón según el método de Zlotkin E. & Shulov A. (7) y liofilizado a -50°C y 35 mBar de presión (Virtes, modelo 10-010). Se liofilizó el TzV de un pool de 35 escorpiones y se reconstituyó en NaCl al 0,9% (Sigma Aldrich S7653). Posteriormente, se centrifugó a 12000g por 10 minutos para eliminar el material insoluble (Eppendorf®, Modelo-5804R). Se determinaron las proteínas contenidas en el sobrenadante mediante el método de Lowry, con el uso de BSA (Armour Pharmaceutical Co.) como estándar (8). Finalmente, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -20°C hasta el momento del ensayo.

Obtención de los acinos pancreáticos

Los acinos se obtuvieron de acuerdo al método descrito por Bruzzone et al. (9) y Williams J. (10). El estudio se realizó en ratones NIH con peso comprendido entre 20-30g, mantenidos con alimento comercial, el cual fue suspendido 12 horas previo al sacrificio, y agua ad libitum

Se sacrificaron por dislocación cervical y se extrajo la pancreata por laparotomía medial. Una vez extraída se colocó en solución amortiguadora de fosfato 0,2M (PBS: NaH2PO4 H2O; Na2HPO4 7H2O) con cóctel inhibidor constituido por: 5,5 μl de cada uno de los siguientes inhibidores de proteasas: aprotinina 2mg/ml (Roche, ROAPRO); pepstanina 1mg/ml (Roche PEP-RO); PMSF 10 mg/ml (Sigma 78830) y leupeptina 1mg/ml (Sigma L-5793). Se burbujeó con carbógeno 95% O2 y 5% CO2 (BOC Gases de Venezuela C.A.) durante todo el ensayo. La pancreata fue seccionada con tijeras de disección y el tejido adiposo fue removido de la superficie del PBS con pipetas Pasteur®. Se realizó un mínimo de tres lavados con PBS sin inhibidores en hielo.

Aislamiento de los acinos

Los acinos se separaron por digestión con colagenasa tipo I (SIGMA C0130). Posteriormente, se incubaron en baño de agua (Precision Scientific modelo 25) con agitación constante durante 10 minutos a 37°C. La suspensión de acinos fue pasada suavemente a través de una aguja de 18G con una inyectadora estéril para ser devuelta al envase, procedimiento que se repite una vez más desde la incubación. A continuación se adiciona el medio de lavado frío KRB-HEPES modificado: NaCl 135,0 mM (Sigma Aldrich S7653), KCl 4,8 mM (Hopkin & Williams); CaCl2, 1,0 mM (Merck 2382); KH2PO4 1,2 mM (Merck 4873); MgSO4 1,2 mM (Merck); NaHCO3 5,0 mM (Hopkin & Williams); glucosa 5,0 mM (Merck 8342); HEPES 12,5 mM (Promega H5303); 80 mg de BSA (Armour Pharmaceutical Co); 30 mg de glicina (Sigma G7176); a pH 7,6 y se deja en reposo sobre hielo por 15 minutos. Posteriormente, se removió un tercio de la solución superficial para eliminar restos del tejido graso y el exceso de colagenasa y luego se repuso el volumen removido con solución de lavado, este procedimiento fue repetido dos veces.

Esta suspensión de acinos pancreáticos se pasó a través de una malla de nylon de 100 μm (Millipore) con la finalidad de remover el resto de los componentes no deseados. Posteriormente, se transvasaron los acinos a un vaso de precipitado de 10mL, se añaden 5 mL de medio de suspensión 1 (10 ml de medio de lavado; 10 mg de BSA) a 5ºC y se deja en reposo por 15 min sobre hielo para separar los acinos (precipitados) del componente graso (superficial).

Finalizado este procedimiento se removió el componente graso hasta un tercio del volumen total, se lavaron los acinos con dos tercios de solución de lavado para eliminar el exceso de BSA. Luego, se añadieron 5 ml de medio de suspensión 2 (10 ml de medio de lavado con 5,5 μl de cada uno de los siguientes inhibidores de proteasas: aprotinina 2mg/ml; pepstanina 1mg/ml; PMSF 10 mg/ml y leupeptina 1mg/ml) a 5ºC, se repite el procedimiento aplicado con la solución 1, y se ajustó a un volumen final de 2,5 ml de medio de suspensión 2. La suspensión de acinos obtenida finalmente fue distribuida en una placa para ELISA, 90 μl en cada pozo y se incubó en el baño térmico con agitación constante a 37°C durante 30 minutos.

Luego de la estabilización, se adicionaron diferentes concentraciones de Cch 0,1μM - 30 μM/pozo (0,0018-5,47 μg/ml) y TzV 10-4 μg - 30μg/pozo. Cada tratamiento se realizó por duplicado. Adicionalmente, se hizo una combinación de la Cch más el TzV y se realizó una curva concentración respuesta. El tiempo de incubación fue de 15 minutos para todos los ensayos.

Terminado el tiempo de incubación se retiró la suspensión de acinos de cada pozo y se colocó en tubos Eppendorf® de 500 μl. La suspensión fue centrifugada a 20854G por 10 minutos a 4°C. Se separó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 20 μl de solución de lisis: Tris base 50mM (Promega H-5131); NaCl 0,25M: EDTA 5mM (Sigma ED 2SS); NaF 4mM (Mallinckrodt Chemical Works); Triton X-100 al 1% (Sharlau TR0444). El sobrenadante y el sedimento fueron almacenados a -20°C hasta el momento del ensayo.

Paralelamente, se tomó una alícuota para verificar la morfología acinar en microscopio a 40x sin tinción. Una vez transcurridos los 30 minutos de estabilización se determina la viabilidad celular con azul de tripano y el número de acinos por ml en cámara de Newbauer.

Determinación de proteínas secretadas al medio extracelular

La concentración de proteínas secretadas al medio extracelular en el sobrenadante se determinó según el método de Lowry modificado por Peterson (11). En resumen, se precipitaron las proteínas con deoxicolato de sodio (DOC) al 0,15% y ácido tricloroacético (TCA) al 72%, posteriormente se aplicó el método de Lowry y la concentración de proteínas se determinó con base a una curva estándar de albumina (0-10μg/ml) en un espectrofotómetro (Beckman, DU 640B) a 750 nm. A los acinos precipitados con solución de lisis se le aplicó el mismo procedimiento con la finalidad de determinar las proteínas totales.

Determinación de la secreción de tripsina

La actividad de tripsina se determinó mediante el método descrito por Bergmeyer et al. (12). En resumen, se determinó por espectrofotometría a una longitud de onda de 253 nm, con cinco lecturas continuas cada minuto, donde se utilizó el N- α- Benzoil-L- Arginina etil éster (BAEE) como sustrato. La reacción se basó en la siguiente ecuación:

BAEE + H2O TripsinaN-Benzoil-L-Arginina + Etanol

Una unidad BAEE de actividad de tripsina a 253 nm con BAEE como sustrato a pH 7,6 y 25 º C produce 0,001U x min, en un volumen final de 3,20 ml. Además, se realizó una curva patrón en función del tiempo con una concentración estándar de tripsina (T4019 Sigma). Las concentraciones del patrón de tripsina utilizada comprendían valores entre 425-575 U/mL.

Determinación de la secreción de amilasa

El principio del método utilizado se basa en el procedimiento descrito por Caraway W. (13). En resumen, consiste en colocar 250μL de sustrato (almidón 0,4g/L; solución de fosfato a pH 7 y estabilizador) en el tubo control y en los tubos que contienen las muestras. Se incubó en baño térmico a 37ºC por 2 minutos. A cada tubo se agregó 50 μL de muestra problema y el equivalente en agua en el tubo control. Posteriormente se incubó en baño térmico a 37ºC durante 7,5 minutos. Seguidamente, se añadieron en todos los tubos 250μL de reactivo indicador (yodato de potasio 16,7mmol/L; yoduro de potasio 271mmol/L y HCl 112 mmol/L) más 2 mL de agua destilada, se mezcló y luego de 5 minutos se determina la absorbancia a una longitud de onda de 660nm.

Aspectos éticos: Este estudio fue evaluado por el Comité de Bioética del Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina de la Universidad Central de Venezuela.

Análisis de datos: Los resultados se expresaron como la media aritmética ± el error estándar de la media (EEM). El análisis estadístico de las diferencias fue realizado mediante el uso de la Prueba “t” de Student o el análisis de varianza de una vía (ANOVA). Los valores de p< 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. El análisis y la elaboración de los gráficos se realizaron con el software de Microsoft® Office Excel 2003 y el programa GraphPad Prism® versión 5.0.3.



Continua: Resultados

Efecto de la Carbamilcolina y el veneno de escorpión Tityus zulianus en la secreción de proteínas de los acinos pancreáticos aislados de ratón NIH
Introducción
Métodos
Resultados
Discusión
Referencias

NOTA: Toda la información que se brinda en este artículo es de carácter investigativo y con fines académicos y de actualización para estudiantes y profesionales de la salud. En ningún caso es de carácter general ni sustituye el asesoramiento de un médico. Ante cualquier duda que pueda tener sobre su estado de salud, consulte con su médico o especialista.





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