Investigación descriptiva con diseño no experimental, transeccional transeccional y de campo, en la cual se estudio una muestra intencionada y no aleatoria conformada por 236 mujeres en edad reproductiva atendidas en el Hospital Materno Infantil “Dr. Rafael Belloso Chacín” (Grupo A), Maternidad “Dr. Armando Castillo Plaza” (Grupo B) y Hospital “Dr. Pedro García Clara” (Grupo C). Se incluyeron mujeres sexualmente activas, con edades entre 18-45 años, reclutadas por diferentes estrategias de convocatoria (bola de nieve, grupos comunitarios organizados y citación por el personal de salud); quienes fueron remitidas a la consulta ginecológica para tamizaje del cáncer de cuello uterino; excluyéndose pacientes con diagnóstico o presunción de embarazo, con diagnóstico confirmado de cáncer cervical o con contraindicaciones para la realización de la genotipificación viral y/o la citología cervico-vaginal, o que no aprobasen la realización de tales procedimientos.

Las pacientes seleccionadas fueron valoradas en la consulta ginecológica, donde con la ayuda de una ficha de trabajo diseñada ad hoc, se asentaron datos socio-demográficos y clínicos obtenidos por medio de la entrevista clínica, así como los resultados de las pruebas y procedimientos realizados. Seguidamente, se realizó una valoración por sistemas y un examen ginecológico, realizándose los siguientes procedimientos:

- Toma de muestra para citología cervico vaginal: con la paciente en posición de litotomía, se procedió a visualizar los genitales externos e introducir un especulo vaginal de Graves desechable y una vez fijado el cuello uterino, se inspeccionó el mismo y se tomaron muestra de endocérvix con un cepillo (citoblush) y con espátula de Ayre para el exocérvix y fondo de saco vaginal posterior. Las muestras recolectadas se extendieron en una lámina portaobjeto, previamente rotulada, y se fijaron con fijador citológico en espray, a una distancia de un metro aproximadamente; manteniéndose almacenadas a temperatura ambiente en un laminario hasta el momento de su procesamiento. Posteriormente, fueron teñidas con la tinción de Papanicolaou y se procesaron en los laboratorios del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital General del Sur, sede del postgrado en esa especialidad de la Universidad del Zulia. Los resultados se reportaron siguiendo la nomenclatura Bethesda y además en el informe de la citología se incluyeron los grados de inflamación observados, la presencia de microorganismos o cambios que sugieren la presencia del VPH (31).

- Toma de muestra para genotipificación de VPH: Se tomó un hisopado del canal endocervical con un hisopo de dacrón esteril, el cual se insertó de 1 a 1,5 cms del orificio cervical externo del cuello uterino (zona de transición escamo-columnar de la región endocervical) y fue rotado 3 veces, retirado del canal e introducido en un tubo que contiene 1 ml de buffer de preservación-lisis estéril como medio de transporte, previamente identificado y rotulado. Las muestras se trasladaron al laboratorio Diagnóstico Molecular (DIAGMOLCA), empresa privada con reconocida trayectoria en la realización de pruebas de biología molecular, mantenidas a 4º C y procesadas dentro de los primeros 3 días de su recepción.

En primer lugar, se realizó la extracción del ADN de las muestras endocervicales. Para ello, se transfirió 500 µl del buffer de lisis, contentivo del hisopo a un tubo de 1,5 ml, se centrifugó a 12.000 rpm por 10 minutos y el sedimento se resuspende en 500 µl de buffer de lisis (50 mM Tris-Hcl pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 150 µg/ml de proteinasa K). La muestra es incubada a 56ºC por 2 horas, los lisados se centrifugan a 14.000 rpm y el sedimento se resuspende en 30 µl de buffer TE; se utiliza 10 µl de la muestra para ensayos de amplificación.

Para la detección y genotipificación viral se llevaron a cabo reacciones de amplificación por PCR utilizando un formato de PCR múltiple que incluyó oligonucleótidos iniciadores dirigidos a secuencias específicas del genoma viral de genotipos de bajo riesgo oncogénico VPH 6/11 (Oligonucleótidos VPH6/!F y VPH 6/11: R GenBank: KC300186.1) y cinco genotipos de alto riesgo oncogénico: VPH 16 (Oligonucleótidos VPH16F y VPH16R: GenBank: KF181718.1); VPH 18 (Oligonucleótidos VPH18!F y VPH18R, GenBank: KC470230.1); VPH 31 (Oligonucleótidos VPH31!F y VPH31R, GenBank: KC662562.1); VPH 33 (Oligonucleótidos VPH33F y VPH 33R, GenBank: JQ976784.1); y VPH 35 (Oligonucleótidos VPH35F y VPH 35R, GenBank: JX129488.1). La identidad y especificidad de los oligonucleótidos se verificó en las bases de datos genómicos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI: National Center for Biotechnology Information) de Estados Unidos. Se incluyeron como control positivo ADN aislado de muestras caracterizadas con el kit Seeplex de Digene, USA y como control negativo se utilizará ADN genómico humano (PROMEGA); dichas reacciones se llevarán a cabo en un termociclador MJ Research PTC-100™.

Los productos obtenidos se analizaron en geles de agarosa al 2 %, los cuales fueron teñidos con bromuro de etidio, visualizados en transiluminador ultravioleta y fotografiados con sistema de fotodocumentación DigiDoc, UVP; una muestra se consideró positiva para uno o más genotipos determinados, cuando el patrón de migración de los productos de PCR amplificados a partir de la muestra, coincida con el patrón de migración (peso molecular) de los productos de PCR específicos de los genomas virales presentes en el control positivo. Los resultados positivos se calificaron según el riesgo oncogénico de los genotipos detectados y en caso de existir co-infección entre genotipos de alto y bajo riesgo se consideró como de alto riesgo.

Todas las pacientes participaron de manera voluntaria, suministrando su consentimiento informado para su inclusión en la investigación y no se encontraron expuestas a riesgos físicos o psicológicos, ni se vulneraban los principios de la Declaración de Helsinki para estudio en humanos; asimismo, el protocolo de estudio fue previamente revisado y aprobado por los comité de bioética de cada uno de los centros de salud donde se ejecutó la investigación. Posteriormente, fueron citadas para la entrega de resultados y los casos donde se detectó el virus o que presentaron alteraciones citológicas se derivaron a la consulta ginecológica para realización de colposcopia, toma de biopsias y recibir el manejo o tratamiento específico.

Para el procesamiento de los datos obtenidos se utilizó el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS), versión 21. Se ejecutó un análisis de tipo descriptivo, donde los mismos fueron expresados en frecuencias absolutas, frecuencias relativas (porcentajes), medidas de tendencia central (medias) o medidas de dispersión (desviación estándar) y se presentaron en tablas de distribución de frecuencias.