Los resultados obtenidos demuestran que la mucosa intestinal cultivada de acuerdo a la metodología desarrollada por Palacios-Prü et al.⁽⁴⁷⁾ y por Longa-Briceño et al.⁽³³⁾ mantiene y preserva in vitro sus características citológicas e histológicas, indistintamente si se cultiva por 24h, 48h ó 72h. En el presente estudio se siguió la técnica de los “cilindros intestinales” previamente reportada por Longa-Briceño et al.⁽³³⁾ la cual permite analizar la interacción directa de la mucosa intestinal con cualquier elemento experimental que se desee, bien sea un microorganismo o una sustancia determinada, el cual se inocula directamente en la luz intestinal.

Al cultivar el intestino delgado conjuntamente con Blastocystis sp. se pudo determinar, de manera directa, los daños ocasionados por este microorganismo en la mucosa intestinal, así como el proceso de internalización del mismo en el tejido. Cuando la incubación fue durante un período de 24h en algunos segmentos muy limitados del epitelio intestinal hay pérdida del borde en cepillo y ausencia del glicocálix. Sin embargo, la mayor extensión epitelial se mantiene intacta, lo cual favorece el adosamiento de Blastocystis a la superficie por la posible interacción de este con el glicocálix, gracias a la presencia de componentes enzimáticos que normalmente intervienen en la incorporación de sustancias en los procesos digestivos.

Los mecanismos celulares que intervienen en la interacción de Blastocystis con las células de intestino humano han sido descritos por Poirier et al.⁽⁴⁸⁾, señalando que inicialmente se produce un proceso de apoptosis acompañado de un aumento de la permeabilidad del epitelio, inmediatamente se detecta una fase proinflamatoria por efecto de enzimas provenientes del microorganismo, fundamentalmente proteasas, que a su vez inducen la participación de las células intestinales aumentando la producción de interleucinas y de factores estimulantes de granulocitos y macrófagos. Además refieren que las proteasas provenientes del Blastocystis pueden fragmentar inmunoglobulinas producidas por el humano y regular respuestas inmunes. Estos hallazgos evidencian la activación de un mecanismo dinámico de pinocitosis en la membrana de la célula epitelial, lo cual favorece la incorporación del microorganismo al citoplasma celular.

En el presente estudio, al prolongar el tiempo de incubación a 48h, el tejido epitelial intestinal pierde su organización histotípica, con pérdida importante de las microvellosidades y del glicocálix, lo cual impide la funcionalidad normal en los procesos digestivos y por ende la imposibilidad de incorporación de sustancias o elementos formes. Este proceso continúa intensificándose hasta las 72h de cultivo, mostrando que grandes extensiones de la mucosa intestinal experimenta un proceso de lisis celular, siendo ocupada la luz intestinal por la presencia de detritus celular.

Tan et al.⁽⁴⁹⁾, Sio et al.⁽⁵⁰⁾, Poirier et al.⁽⁴⁸⁾ han reportado la acción de proteasas que intervienen en la alteración del glicocálix de las células del epitelio intestinal e igualmente demuestran la capacidad de Blastocystis de inducir la muerte celular programada, lo cual explica las observaciones realizadas en el co-cultivo. Estas acciones de Blastocystis son más evidentes y más acentuadas a mayor tiempo de incubación, debido probablemente a la acción de un mayor número de microorganismos logrando así alterar mayor superficie expuesta.

Es importante destacar que en los segmentos deteriorados de la mucosa intestinal, observados en los cultivos de 72h, hacia la parte más alejada de la luz intestinal pueden encontrarse células propias de la mucosa que mantienen su citoarquitectura y entre ellas se observa la presencia de macrófagos activos, pudiendo significar esta actividad fagocítica, una respuesta no específica al daño celular con el fin de participar en la eliminación de los residuos y detritus productos de la degeneración celular, o una respuesta específica a la presencia del Blastocystis sp. en el tejido intestinal.

Los cultivos de 48h presentan un deterioro de la mucosa intestinal en la zona apical con pérdida del glicocálix y aumento de detritus celular que se va incrementando con el tiempo de incubación y que a las 72h se evidencia como un estado de lisis citológica total, donde es imposible identificar organelas citoplasmáticas intactas, hay pérdida de las microvellosidades y destrucción del citoplasma, aumentando de forma significativa la presencia de detritus celular luminal. En los cultivos de 72h se observa la acción de macrófagos los cuales no contienen células del parásito y probablemente sean una respuesta a la presencia de los restos celulares producidos por la interacción del parásito con los enterocitos.

Es controversial la información encontrada sobre la patogenecidad de este microorganismo, Domínguez⁽²³⁾ refiere bajos niveles de patogenicidad y lo describen simplemente como un agente comensal, donde los aspectos clínicos del paciente dependen de la existencia en el tracto intestinal de bacterias, virus y otros protozoarios asociados, más que de la presencia de Blastocystis. Por el contrario, otros autores^(51,52,32) demuestran que Blastocystis sp. posee un alto potencial patogénico en modelos animales, así como en estudios in vitro.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo corroboran la capacidad patogénica y los efectos histológicos de este protozoario sobre la mucosa intestinal de ratón. Tan⁽³²⁾ describe que no hay modelos animales que permitan la total comprensión sobre los efectos y los posibles mecanismos de infección de Blastocystis; es por ello que el modelo propuesto en esta investigación representa un método directo para determinar los posibles mecanismos de infección de este protozoario a la mucosa intestinal, como se demostró con la internalización del microorganismo infiltrando el epitelio intestinal (24h), acompañado por un proceso inflamatorio, efectos citopáticos e inmunes en la mucosa intestinal. Igualmente se observó un aumento en la pérdida de las microvellosidades a medida que se prolongó el tiempo de incubación (48h y 72h), así como un evidente deterioro histológico con un gran aumento de detritus que podría explicar las manifestaciones de signos y síntomas digestivos, presentes en pacientes sintomáticos.

Otro hallazgo importante en este estudio es la respuesta fagocítica observada en el tejido epitelial (72h) que podría representar una repuesta inmune del tejido ante la presencia Blastocystis. Tan⁽³²⁾ también propone distintos modelos sobre la patogénesis de Blastocystis, como son: liberación de proteasas-cisteína, disrupción de la barrera epitelial, apoptosis de la células del hospedero e inducción de procesos inflamatorios y consideramos que a los anteriores se debe agregar la infiltración de la lámina propia y de la submucosa del epitelio intestinal como lo demostramos en este estudio, que a la vez corrobora los hallazgos obtenidos por Moe et al.⁽⁵¹⁾ y por Elwakil & Hewedi⁽⁵²⁾. Consideramos que este estudio y el modelo experimental utilizado puede ser un aporte para profundizar en un tema que actualmente está ocasionando graves problemas de salud pública, principalmente en poblaciones desasistidas sanitariamente.

Agradecimientos

Al Personal del Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü” quienes con su asistencia y conocimientos formaron parte en la realización de la presente investigación y al Personal del Bioterio Central de la Universidad de Los Andes por su invalorable colaboración en el manejo y suministro de los animales de experimentación.