Los cálices de H. sabdariffa, fueron obtenidos de plantaciones propias por los investigadores, ubicada específicamente en el sector Coropo, Santa Rita del estado Aragua Venezuela Junio-Diciembre de 2019. Estos fueron deshidratados y almacenado libre de humedad, hasta su análisis en el Laboratorio de Metales Pesados y Solventes Orgánicos de la Universidad de Carabobo, sede Aragua (Figuras 1 y 2).

Figuras 1 y 2. Material vegetal empleado en el estudio (cálices de H. sabdariffa)
Fuente: Elaboración de los autores

Extracto acuoso y muestra biológica

Los extractos se prepararon con 2,5 g de cálices secos y 100 mL de agua destilada. Se dejó hervir por 15 min, se separó el lí­quido de los cálices por decantación y la extracción se repitió en las mismas condiciones por triplicado. Los extractos se filtraron con papel Whatman No. 4 y se aforó a 200 mL con agua destilada ¹³.

Se realizó la extracción sanguínea, previa asepsia y empleando un tubo de tapa morada con ácido eltilendiaminotetraacético (EDTA) sellado al vacío con aguja vacuntainer. Estas muestras fueron obtenidas de tres pacientes ambulatorios que acudieron al Laboratorio de Metales Pesados y Solventes Orgánicos por exámenes de hematología completa y química sanguínea, a los cuales se les explicó el propósito de la investigación obteniendo así su consentimiento infirmado aprobado por el Consejo Técnico del Centro de Estudio en Salud de los Trabajadores (CEST-UC), fundamentado bajos los criterios bioéticas. Los tres participantes estaban en ayunas de menos 8 h, y se verificó que no presentaran hipercolesterolemia.

Determinación de fenoles totales

La determinación de fenoles se realizó por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu. 50 µL de muestra fueron adicionados a 125 µL del reactivo de Folin, y 400 µL de carbonato de sodio 7,1% (p/v), completándose con agua destilada hasta 1 mL. Este procedimiento se realizó por quintuplicado. Seguidamente se prepararon 5 patrones de concentración de 50, 100,150, 200 y 250 µg/mL, a partir de una solución patrón madre de Ácido Gálico (fenol) de concentración 500 µg/mL. Por último realizó la lectura a 760 nm empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (Thermo Scintific). Los resultados se expresaron como mg de GAE / g de material vegetal (MV) ¹⁴.

Ensayo de oxidación de LDL

Para evidenciar la inhibición de la oxidación de LDL se procedió de acuerdo a lo propuesto por Zhang y cols. 2001 y modificada por Ruiz y cols.2006 (7,8). Los tubos se agitaron con un vórtex y llevados a una temperatura de 2 °C du­rante 15 min, para luego se nuevamente agitados y centrifugados a 5000 rpm a 4 °C durante 5 min. El sobrenadante que corresponde al plasma se transfirió volumétricamente a un tubo falcon estéril de 15 mL y se adicionó el reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico 500 mM y cloruro de magnesio 500 mM) en relación 2:1 v/v con el plasma obtenido. El reactivo precipitante y el plasma se agitaron durante 2 min en vórtex y posteriormente se centrifugaron a 3000 rpm a 4 °C durante 10 min. El sobrenadante obtenido (LDL) este se con buffer de fosfatos 10 mM y 0,16 M de NaCl, pH 7,4 hasta 100 mL. Se­guidamente se llevó a cabo la oxidación de las LDL que consistió en tomar 115 μL de solución de LDL, 100 μL de extracto acuoso con buffer de fosfatos, 235 μL de buffer de fosfatos salino y 50 μL de CuSO₄ 100 μM, el cual actúa como oxidante de las LDL (control). La mezcla se agitó en vórtex durante 2 min y luego se incubó a 37 °C en agitación durante 8 h. Para detener la oxidación las muestras fueron transferidas por una columna de Sephadex G-50, tomando 550 μL del eluido y 500 μL de ácido tricloroacético (ATA) 25 % p/v. Posteri­ormente se adicionaron 500 μL de ácido tiobarbitúrico 1% p/v. Se agitó nuevamente en vórtex durante 1 min y se incubó a 95 °C por 1 h en oscuridad. Posteriormente se dejó enfriar durante 1 h, en oscuridad a temperatura ambiente (25 °C) y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Se realizó una curva de calibración del método de sustan­cias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y se utilizó como estándar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP) en concentraciones de 0,5 a 10 μM. Se midieron las absorbancias de las muestras y patrones y los resultados se expresados como μg TMP/100 g de MV ^5,16.

Análisis estadístico

Todas las determinaciones de las muestras y de los controles se realizaron por triplicado. Para comparar cada efecto del extracto respecto a su control de cada paciente, se aplicó un análisis de varianza de dos vías con interacción (ANOVA), usando el programa Statistix 9.0 para Windows.