Tipo de Investigación.

El presente trabajo es una investigación descriptiva de tipo experimental, donde se somete un cultivo de células leucémicas (monocitos) U937, a la presencia de diferentes concentraciones del nuevo complejo de oro BmAu y glutatión, con la finalidad de determinar la participación de las especies reactivas de oxigeno en los efectos apoptóticos y antiproliferativos de dicho complejo.

Muestra biológica.

Para cumplir con los objetivos planteados se realizaron una serie de ensayos in vitro utilizando como muestra biológica monocitos leucémicos U937 (donada por el Instituto de Inmunología de la Universidad Central de Venezuela). Estas muestras han sido cultivadas y mantenidas in vitro en el Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Carabobo (BIOMED-UC).

Procedimiento experimental.

Preparación del medio de cultivo y soluciones.

Se preparó la solución madre de BmAu 10 mM en DMSO y a partir de esta se obtuvieron las soluciones de trabajo de 0,1, 1, 5 y 10 µM. Por otra parte, el suero fetal bovino fue inactivado térmicamente (a 56 ºC por 30 min). El medio de cultivo se preparó disolviendo 10,4 g de RPMI 1640 sólido, 1 g de NaHCO₃, por cada litro de solución, adicionalmente fue suplementado con 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina, y finalmente, esterilizado por filtración con membranas de 0,2 µm. El pH del medio de cultivo fue ajustado a 7,4 con Hepes 500 mM. Para la preparación

Cultivo celular

La línea celular de monocitos leucémicos U937 cultivaron en medio de RPMI 1640, suplementado con suero fetal bovino 10% v/v y glutamina 1 mM en atmósfera húmeda de CO₂ al 5% en aire y a 37 ºC.

Determinación de la necrosis y apoptosis de las células U937 en ausencia y en presencia de glutatión mediante microscopia de fluorescencia.

En la microscopia de fluorescencia el uso del colorante fluorescente naranja de acridina (NA) permite cuantificar el número de células que dentro de una población han sufrido apoptosis. Sin embargo, ese colorante no permite diferenciar entre células viables y no viables. Para hacer esta distinción, se puede recurrir a una mezcla de NA y Bromuro de etidio (BE) ya que la captación diferencial de estos dos pigmentos permite dicha diferenciación (9). Las células U937 (1x10⁶ células/mL) se incubaron con el complejo de oro en una microplaca de 96 pozos: en cada pozo se colocará 196 µL de células (diluidas ½), 2 µL de glutatión a concentración fija de 10 mM y 2 µL del complejo de oro BmAu, a diferentes concentraciones. En ausencia de glutatión se colocaron 198 µL de células (diluidas ½) y 2 µL del complejo de oro BmAu a diferentes concentraciones para ser incubadas en atmósfera húmeda de CO₂ al 5% a 37 ºC durante 24 y 48 horas. Al finalizar la incubación, se homogeneizaron las células en los mismos pozos de la microplaca. Se centrifugo 200 µL de las células homogeneizadas a 2000 rpm por 5 min en viales de 500 µL. Posteriormente se descarto el sobrenadante y se resuspendieron el sedimento de células con 200 µL de solución amortiguadora de PBS pH 7,4.Las células U937 se tiñeron con 1 µL de solución de NA/BE 1:1(v/v) [NA en PSB pH 7.4) (100 µg/mL)], se mezclo suavemente y se examinaron a través de un microscopio de fluorescencia Leica Modelo DMLS bajo luz azul.

Este método permitó la identificación de células con diferentes estadios según un patrón de coloración, tal como se describe a continuación:

i) Células viables: la cromatina se observa verde brillante con estructura organizada y citoplasma rojo.

ii) Células apoptóticas: la cromatina se observa verde brillante y altamente condensada o fragmentada.

iii) Células necróticas: la cromatina se observa naranja brillante y citoplasma de aspecto rojizo.

iv)

Determinación de la viabilidad celular en ausencia y en presencia de glutatión mediante el método de exclusión de azul tripano.

Se basa en la capacidad que tienen las membranas celulares intactas de expulsar el colorante azul tripano una vez que ha difundido pasivamente al interior celular. Las células viables, cuya membrana celular está intacta, excluyen el colorante y se observan refringentes mientras que las no viables (necróticas) adquieren una coloracion azul cuando se observan al microscopio óptico (10). Se colocaron en un portaobjeto 20 µL de una solución de azul tripano al 0,4% (p/v). Se cubrió con una laminilla y se observó al microscopio óptico (Carl Zeiss, Modelo Axiolab) con objetivo de 20X, contando el número de células no teñidas por cada 100 células contadas. Los resultados se expresaron como porcentaje de necrosis.

Análisis de Datos.

Se realizo el análisis estadístico de los resultados utilizando el programa GraphPad Instat versión 3.01 para Windows, siendo expresados como Media ± Desviación Estándar de la propiedad determinada para la totalidad de los ensayos realizados. También se empleo un análisis de varianza y la prueba de Dunett.

La representación de los resultados en tablas y gráficos fueron realizados utilizando el programa GraphPad Prism versión 4.0 para Windows.