En el presente trabajo se evaluaron los efectos del complejo BmAu sobre la necrosis, apoptosis y proliferación de la línea celular U937 para lo cual se hizo necesario realizar incubaciones a 24 y 48 horas en ausencia y presencia de GSH con un rango de concentraciones de BmAu entre 0,1 y 10 µM. La presencia de GSH tiene como finalidad dilucidar si los efectos evaluados se relacionan con especies reactivas de oxigeno y rutas de estrés oxidativo.

Efectos del complejo BmAu sobre la necrosis de células U937 en ausencia de GSH.

Para medir el efecto sobre la necrosis de las células U937 se empleó el método de microscopia de fluorescencia (naranja de acridina y bromuro de etidio) mediante el cual se logró determinar el % de necrosis a diferentes tiempos de incubación. Los resultados mostrados en la figura 2 (Panel A) muestra que a las 24 horas de incubación con BmAu, se evidenció un efecto estadísticamente significativo sobre la necrosis en todo el rango de concentraciones entre 1-10 µM. Por su parte, se observó que a las 48 horas de incubación (Panel B) el incremento en el % de necrosis a las concentraciones de 1 y 5 µM fue más evidente aunque con la misma significancia.

Fig. 2. Efectos del BmAu sobre la necrosis de células U937 a diferentes tiempos de incubación en ausencia de GSH. Las células U937 (10⁶cel/ml) fueron incubadas con BmAu a las concentraciones señaladas durante (A) 24 y (B) 48 horas. La necrosis fue determinada mediante microscopia de fluorescencia. ** p<0,01 (Dunnett; n=6).

Efectos del complejo BmAu sobre la necrosis de las células U937 en presencia de GSH.

Para medir el efecto de BmAu sobre la necrosis en presencia de 10 mM GSH se empleo la misma metodología anteriormente mencionada, pero solamente utilizando las concentraciones 1 y 5 µM de BmAu. Los resultados de la Figura 3 indican que la presencia de GSH ejerció su acción antioxidante porque disminuyó el % de necrosis a las 24 horas y 48 horas a la concentración de 1 µM con respecto, al obtenido para ambos tiempos de incubación en ausencia de GSH. Para una concentración de 5 µM de BmAu no se evidencia que la presencia de GSH haya logrado revertir el efecto observado para ambos tiempos de incubación en ausencia del mismo (Figura 2A y 2B).

Fig. 3. Efectos del BmAu sobre la necrosis de células U937 a diferentes tiempos de incubación en presencia de GSH adicionado 10 min después del complejo. Las células U937 (10⁶ cel/ml) fueron incubadas con BmAu a las concentraciones señaladas durante (A) 24 y (B) 48 horas. La necrosis fue determinada mediante microscopia de fluorescencia. ** p<0,01 (Dunnett; n=6).

Efectos del complejo BmAu sobre la apoptosis de las células U937 en ausencia de GSH.

La condensación y fragmentación de la cromatina son eventos morfológicos característicos de la apoptosis tardía que puede ser fácilmente observable utilizando la microscopia de fluorescencia tiñendo las células con una mezcla de naranja de acridina y bromuro de etidio. Así, mediante la aplicación de esta técnica se demostró que a las 24 horas de incubación figura 4 (Panel A), hubo un aumento significativo de la apoptosis a las concentraciones de 1 y 5 µM. Por otra parte, se observó que a las 48 horas Figura 4 (Panel B) solo la concentración de 1 µM mantuvo el efecto proapoptótico descrito en tiempos de incubación menores.

Fig. 4. Efectos del BmAu sobre la apoptosis de las células U937 a distintos tiempos de incubación en ausencia de GSH y determinadas por microscopía de fluorescencia. **p< 0,01 y ***p< 0,001 (Dunnett; n= 6).

Efectos del complejo BmAu sobre la apoptosis de las células U937 en presencia de GSH.

La figura 5 (Panel A), revela que en presencia de GSH durante 24 horas de incubación la concentración 1 µM, no produjo un efecto apoptótico significativo; es decir, que en comparación con los resultados en ausencia de GSH el efecto proapoptótico fue revertido mientras que a la concentración de 5 µM el efecto proapoptótico con respecto al control fue evidente. Por otra parte, a las 48 horas de incubación se evidencio un incremento significativo de la apoptosis a ambas concentraciones con respecto al control, lo que permite presumir que se deba a un agotamiento de GSH adicionado al medio de incubación. Figura 5 (Panel B)

Fig. 5. Efectos de BmAu sobre la apoptosis a distintos tiempos de incubación en presencia de GSH adicionado 10 min después del complejo y determinadas por microscopía de fluorescencia. *p< 0,05, **p< 0,01 (Dunnett; n=6).

Efectos del complejo BmAu sobre la proliferación de las células U937 en ausencia de GSH.

Para determinar el efecto de BmAu sobre la proliferación de U937 se utilizaron aquellas concentraciones que causaron efectos significativos sobre la necrosis y la apoptosis en los ensayos previos. Para ello se realizó un contaje celular con una cámara de Neubauer y los resultados se expresaron en cel/mL. Los resultados de la figura 6, muestran que las concentraciones de 1 y 5 µM inhibieron la proliferación celular tanto a las 24 como a las 48 horas.

Fig. 6. Efectos de BmAu sobre la proliferación de las células U937 en ausencia de GSH incubadas por 24 y 48 horas cuantificadas en cámara de Neubauer. ***p< 0,001 (Dunnett; n=6).

Efectos del complejo BmAu sobre la proliferación de las células U937 en presencia de GSH.

Fig. 7. Efectos de BmAu sobre la proliferación de las células U937 en presencia de GSH adicionado 10 min después del complejo e incubadas por 24 y 48 horas respectivamente y cuantificadas en cámara de Neubauer. ***p< 0,001 (Dunnett; n=6).