En general la absorción de biomacromoléculas está muy restringida debido a su composición, ya que la piel solo permite la absorción de moléculas pequeñas y moderadamente lipofílicas, por lo que la administración de genes resulta desafiante. Otro reto lo representa la falta de vasculatura en la epidermis y la estrecha zona de unión epidérmica-dérmica que impiden el suministro o penetración de biomacromoléculas. ⁽³⁾

El sistema CRISPR/Cas necesita estrategias de entrega in vitro, in vivo y ex vivo para ejercer su función en el tratamiento de enfermedades, lo cual dependerá de las propiedades de barrera de la piel, la carga genética, el alto peso molecular, cargas negativas e inestabilidad biológica. Este sistema puede administrarse a las células de tres formas diferentes ⁽³⁾:

ARNm + sgRNA: Es una estrategia rápida pero el mRNA puede traducirse en el citoplasma. Con mala estabilidad debido a su rápida degradación, lo que limita la duración de la edición de genes. Presenta bajo efecto fue del objetivo. ⁽²⁾

ADN plasmídico (pADN): Este codifica Cas9 y sgRNA. Estabilidad alta, baja eficiencia ya que amerita ingreso al núcleo. ⁽²⁾

Complejo de robonucleoproteína sgARN (RNP): Alta eficiencia de edición, no requiere procesos de transcripción y traducción, por lo que inicia la edición del genoma rápido y reduce efectos fuera del objetivo, baja inmunogenicidad, difícil de empaquetar por el gran tamaño de la enzima Cas9. ⁽²⁾

Esto demuestra que entregar el sistema CRISPR/Cas a su objetivo con alta eficacia y precisión es complejo y difícil. Por ello se diseñaron métodos de entrega física, entrega viral y entrega no viral. ⁽²⁾ (Figura 3)

Figura 3. Métodos de entrega del sistema CRISPR/Cas (*)

(*) Adaptado de Huang y col. (2022

Métodos de entrega física: Los métodos físicos y disruptivos de barrera tienen un gran potencial para la entrega de genes a la piel. ⁽³⁾

Electroporación: Es el método más ampliamente estudiado. Genera pulsos eléctricos de alta intensidad (50-500 V) que produce una alteración del potencial eléctrico de la membrana celular creando transitoriamente poros acuosos en las bicapas lipídicas del estrato córneo lo que facilita la entrada de biomacromoléculas, como ARN/ADN o CRIPSR/Cas por el impulso eléctrico, con posterior reparación de la membrana. Dentro de sus desventajas se incluyen la muerte celular por cambios de pH. ^(2)(3)(19)

Iontoforesis: Implica la aplicación de corrientes eléctricas fisiológicamente aceptables (0,1-1,0 mA/cm2) para conducir fármacos iónicos a través de la piel a favor del gradiente de potencial y concentración. ⁽¹⁹⁾

Sonoporación o aplicación de ultrasonido: Permeabiliza temporalmente la membrana celular y facilita la penetración de carga genética en las células, a través de frecuencias de ultrasonidos bajas y medias (20kHz a 16MHz), desencadenando la formación de burbujas llenas de vapor, que finalmente colapsan y forman poros en la membrana celular, con la limitante de que la transferencia en comparación con la electroporación no es uniforme. ^(3)(19)

Microagujas: Interrumpen el estrato córneo mediante la formación de poros microscópicos a través de los cuales las biomacromoléculas pequeñas penetran en la epidermis, cerrándose en 1 hora y dejando la piel intacta. Permiten el paso desde pequeñas moléculas hidrófilas hasta macromoléculas de alto peso molecular. Son indoloras, mínimamente invasivas ya que la longitud es de 500 micras por lo que no alcanzan los nervios de la dermis. Combina la facilidad del uso de un parche transdérmico con la eficacia de administrar fármacos con jeringas y agujas hipodérmicas. Se diseñan matrices para mejorar el contacto con la piel y facilitar la penetración. Dentro de sus limitantes se encuentra la capacidad de carga limitada y cuando se trate de administraciones en todo el cuerpo. ⁽³⁾

Métodos de entrega de vectores no virales:

Es un campo de investigación emergente. Permite mediar el transporte de los componentes de CRISPR por las propiedades fisicoquímicas de los vectores sintéticos o naturales. Actualmente los vectores no virales reportados en la literatura son las nanopartículas (de lípidos, polímeros, ADN, inorgánicas). Pueden utilizarse in vitro o in vivo, permitiendo mejorar la seguridad y reducir la inmunogenicidad. ⁽²⁾

Las nanopartículas de lípidos (LNP) son unos de los sistemas más utilizados y avanzados. Consiste en combinar un ácido nucleico con carga negativa y liposomas con carga positiva, generando interacción electrostática, formando nanopartículas lipídicas. Este componente lipídico permite al ácido nucleico cruzar la capa lipídica externa, evitando la reacción inmunitaria. Permitiendo la entrega de material genético de cualquier tamaño. ⁽²⁾⁽³⁾

Las nanopartículas de polímeros catiónicos forman complejos esféricos con carga genética negativa por interacciones electrostáticas. Transportan componentes CRISPR a través de las membranas mediante endocitosis permitiendo entregar la carga a los objetivos y una liberación controlada. Los polímeros más utilizados son la polietilenimina (PEI), poliamidoamina (PAMAM) y quitosano (CS). Sin embargo, dependiendo del tamaño pueden causar citotoxicidad, por lo que son parámetros que deben mejorarse para las aplicaciones clínicas. ⁽²⁾⁽³⁾

Los exosomas son nanovesículas liberadas de forma natural por las células con un tamaño que oscila entre 40 y 160 nm. Su biocompatibilidad, capacidad de transporte, estabilidad en el torrente sanguíneo y su capacidad de ingeniería han hecho considerable su uso como posible tecnología de entrega para los componentes CRISPR. Varios estudios han indicado que mediante la electroporación, el ADN plasmídico o los mRNA basados en Cas9 pueden cargarse en los exosomas purificados. Esta tecnología ha demostrado muchas ventajas como baja inmunogenicidad, alta biocompatibilidad, cruce de barreras biológicas, pero existe riesgo de integración de fragmentos de ADN durante la edición del genoma a gran escala. ⁽²⁾

Métodos de entrega de vectores virales:

Los vectores virales son los portadores más efectivos para la entrega de genes debido a su capacidad innata para infectar tanto células en división como quiescentes. (3)

Los vectores virales contienen virus adenoasociados (AAV), adenovirus (AdV) y lentivirus. Los AAV y AdV tienen la capacidad de infección inherente sin desencadenar problemas por mutagénesis por inserción. El conjunto de partículas virales se empaqueta con Cas9 y sgARN, luego infectan la célula objetivo que se transportan al cuerpo o se estudian in vitro. ^{(2) (3)}

Los AAV tienen un buen perfil de seguridad y potencial terapéutico, por lo que se han aprobado para ensayos clínicos en terapia génica. Su inmunogenicidad es significativamente menor que otros virus. ⁽

El lentivirus es un virus ARN monocatenario. Está desprovisto de múltiples propiedades virales y no activan al sistema inmunitario. Como retrovirus se integra en el genoma del huésped, aumentando el riesgo de mutagénesis insercional fuera del objetivo. (2)

El mayor de los desafíos es el tamaño limitado de la carga que pueden llevar, siendo superado muchas veces por lo que han diseñado vectores duales, uno para Cas y otro para sgRNA, que debe ser entregado simultáneamente. Por lo que el diseño de estos vectores virales requiere procesos de fabricación complejos y costosos. (3)

En general para avanzar en el campo de la terapia génica cutánea se necesita una mejor comprensión de cómo administrar la terapia génica de manera segura y eficiente en células diana. Se necesita incorporar el uso de modelos relevantes para humanos. Esto aumentará las perspectivas de implementación a gran escala.