La B. megalandra utilizada en estos experimentos fue identificada por El Dr. Stefen Tillett del Herbario Ovalles de la Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela. Inicialmente medimos los efectos del extracto acuoso de las hojas de B. megalandra ⁽⁹⁾ sobre la neoglucogénesis de rebanadas de hí­gado de rata, incubadas en Krebs Ringer bicarbonato suplementado con albúmina bovina saturada con oleato y utilizando lactato o fructosa como substrato neoglucogénico. Como se puede observar en la Tabla 1, la actividad neoglucogénica de las rebanadas controles es lineal hasta los 90 min. e igual con los dos substratos.

Tabla 1 Rebanadas de hí­gado de ratas ayunadas por 48 horas fueron incubadas en 4ml de amortiguador Krebs-Ringer bicarbonato, suplementado con albúmina de suero bovino saturada con oleato y usando lactato o fructosa como substrato neoglucogénico, en la ausencia(control) o presencia de 9 UA_264rm del extracto de las hojas de B. megalandra. En los tiempos indicados, en muestras del medio de incubación se determinó la glucosa por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa⁽²⁹⁾. Los resultados se expresan en nmol de glucosa producidos/ mg de peso seco de hí­gado y corresponden al promedio de 8-13 experimentos ± la desviación estándar. Las diferencias observadas entre controles y tratadas con el extracto de la planta fueron estadí­sticamente significativas a p<0.05 para fructosa y p<0,005 para lactato.

En la presencia del extracto de la planta ocurre una drástica disminución de la neoglucogénesis, siendo más marcada a partir de lactato que de fructosa; estos resultados sugieren que en el extracto de B. megalandra están presente compuestos que bloquean dicho proceso en un punto más allá de la entrada de ambos substratos. Como se muestra en la Tabla 2, cuando se usó G-6-P como substrato de la G-6-Pasa de microsomas intactos, el extracto foliar disminuyó de manera estadí­sticamente significativa la V_MAX con una moderada elevación del K_M sin afectar la actividad de la enzima de microsomas rotos ⁽⁹⁾.

El extracto de la planta, no tuvo efecto alguno cuando el substrato de la enzima fue PPi, tanto en microsomas intactos como rotos; lo cual sugiere que el efecto del extracto de B. megalandra se ejerce sobre uno de los transportadores del sistema de la G-6-Pasa probablemente sobre T1 ⁽⁹⁾. Posiblemente la inhibición de la neoglucogénesis hepática sea el resultado de la inhibición de la G-6-Pasa por los compuestos presentes en el extracto de la planta. Al medir el efecto que durante el tiempo, ejerce el extracto de la planta sobre la actividad de la enzima en microsomas no tratados (Figura 4) se observó que: en los controles la actividad de la G-6-Pasa fue lineal durante 30 min., en la presencia del extracto de B. megalandra la actividad de la enzima también fue lineal hasta los 20 min. pero por debajo del control, después de este punto ocurre una inflexión con una lí­nea entre 20 y 30 min. con una pendiente menor, sugiriendo que por efectos de la presencia del extracto foliar probablemente se inhibe otro de los transportadores del sistema de la G-6-Pasa acumulándose los productos de la reacción enzimática los cuales inhibirí­an la subunidad catalí­tica ⁽⁹⁾. En vista de que los parámetros cinéticos de la G-6-Pasa usando PPi como substrato no fueron afectados por el extracto de la planta, posiblemente el transportador inhibido sea T3.

Figura 4. Efectos del extracto acuoso de las hojas de B. megalandra en la actividad de la G-6-Pasa durante el tiempo. La actividad de la G-6-Pasa microsomal hepática fue medida en la ausencia (■) o en la presencia de 0,28 UA_{264 nm} del extracto de las hojas de B. megalandra (●) usando 15 mM de G-6-P como substrato. Cada punto representa el promedio de 5 experimentos ± la desviación estándar. Todas las diferencias observadas entre las actividades de la enzima incubada en la ausencia o presencia del extracto de las hojas fueron estadí­sticamente significativas a p< 0,02; con la excepción de la obtenida a los 20 min. que no fue estadí­sticamente significativa.

Purificación de flavonoides de B. megalandra y cuantificación de sus efectos.

A partir del extracto metanólico de las hojas frescas de B. megalandra logramos purificar 8 flavonoides ⁽¹⁰⁾, la mayorí­a de ellos como quercetina y kanferol o sus derivados y se midió el efecto que estos compuestos ejercen sobre la actividad de la G-6-Pasa. Las agliconas mostraron la menor actividad inhibitoria, los compuestos glicosilados con ramnosa presentan una actividad intermedia y cuando la ramnosa se encuentra esterificada al ácido gálico, la inhibición supera el 60 %. Vale la pena destacar que el efecto inhibitorio solo se observa en los microsomas intactos (Tabla 3) lo cual sugiere fuertemente que estos flavonoides afectan uno de los transportadores, probablemente T1, del sistema de la G-6-Pasa.  Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se describe la presencia de kanferol 3-O-α-(2"�galoil)-ramnosa como producto natural cuya estructura, conjuntamente con la de quercetina 3-O-α-(2"�galoil)-ramnosa, se muestra en la Figura  5

Figura 5. Estructura quí­mica de la Quercetina 3-O-α-(2"�galoil)ramnosa (R = OH) y del Kanferol 3-O-α-(2"�galoil)ramnosa (R = H)

Se encontró una correlación entre el % de inhibición de la actividad de la G-6-Pasa de microsomas intactos y el valor del IC₅₀ ejercidos por los compuestos estudiados; las agliconas: kanferol y quercetina, la quercetina glicosilada con arabinosa (una pentosa) y la astilbina presentan valores de IC₅₀ elevados y porcentajes de inhibición bajos; la quercetina y el kanferol glicosilados con ramnosa (una hexosa) poseen valores intermedios de IC₅₀ y porcentajes de inhibición intermedios y los flavonoides unidos a ramnosa y ácido gálico exhibieron IC₅₀ del orden de 30 μM y mostraron inhibición de la actividad de la enzima cercana al 60 %. Se utilizó como control positivo floricina, un conocido inhibidor de T1 de la enzima ⁽¹¹⁾, el cual mostró un efecto inhibitorio similar al ejercido por el kanferol y la quercetina unidos a ramnosa pero un valor de IC₅₀ (466 μM) el cual es cercano al doble del mostrado por los primeros; siendo la primera vez que se reporta el IC₅₀ de la floricina para la G-6-Pasa de microsomas intactos. Como se muestra en la Tabla 4, quercetina 3-O-α-(2"�galoil)-ramnosa (QGR) incrementó considerablemente el K_M para G-6-P sin modificar la V_MAX de la G-6-Pasa de microsomas intactos, tampoco afectó los parámetros cinéticos de la enzima de microsomas rotos. Cuando se usó PPi como substrato (Tabla 4), los parámetros cinéticos de la G-6-Pasa tanto de microsomas intactos como rotos no fueron afectados por la presencia de QGR. Estos resultados sugieren fuertemente que QGR es un inhibidor competitivo del transportador T1 del sistema de la G-6-Pasa ⁽¹²⁾. La capacidad neoglucogénica de rebanadas de hí­gado de ratas ayunadas por 48 horas e incubadas en la ausencia (control) o presencia de 30 μM QGR se muestra en la Fig. 6.

Figura 6. Efectos de la quercetina 3-O-α-(2"�galoil)-ramnosa sobre la neoglucogénesis hepática. Rebanadas de hí­gado de ratas ayunadas por 48 h. fueron incubadas en amortiguador Krebs-Ringer bicarbonato suplementado con albúmina bovina saturada con oleato y usando lactato como substrato neoglucogénico en la ausencia (■) o presencia de 30 μM QGR (●). A los intervalos de tiempos indicados se tomó muestras del medio de incubación con la finalidad de estimar la glucosa producida por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa (29). Los valores se expresan como nmol de glucosa producidos por mg de peso seco de hí­gado y corresponden al promedio de 6-9 experimentos ± la desviación estándar. Todas las diferencias entre las rebanadas controles y tratadas con QGR fueron estadí­sticamente significativas a p< 0,005.

La producción de glucosa por las rebanadas controles fue prácticamente lineal y muy similar a lo reportado antes ⁽⁹⁾. QGR inhibió drásticamente la capacidad neoglucogénica de rebanadas de hí­gado de ratas a todos los tiempos estudiados: a 30 min. la inhibición fue de aproximadamente 85 %; cercana al 50 % a los 60 min. y de un 41 % a los 90 min. Aun cuando la inhibición de la capacidad neoglucogénica de las rebanadas de hí­gado por la presencia del flavonol en el medio de incubación parece disminuir con el tiempo de incubación, sin embargo una observación detallada de la Fig. 6 muestra que la pendiente de la lí­nea que representa el efecto del flavonol, luego de los 20 min. iniciales, es 0.74 lo cual es considerablemente menor que 0.97 de la condición control.