Las muestras clí­nicas objeto de este estudio, se obtuvieron en diferentes Laboratorios del área capitalina, las mismas fueron tomadas, siguiendo las normas del Código de Bioética y Bioseguridad del FONACIT ⁽²²⁾ a pacientes con cuadros clí­nicos de origen infeccioso tales como meningitis, infecciones del tracto respiratorio superior e inferior, otitis externa, neumoní­a, infecciones de heridas quirúrgicas, infección del tracto génito-urinario y sepsis. Los criterios de exclusión fueron la administración de tratamiento antimicrobiano durante los siete dí­as previos a la toma de la muestra y el aislamiento de bacterias diferentes a las del estudio.

Posteriormente, se transportaron al Laboratorio de Patogenicidad bacteriana de la Escuela de Bioanálisis donde fueron procesadas de inmediato según el procedimiento de la Sociedad Americana de Microbiologí­a ⁽²³⁾.

Las cepas controles utilizadas fueron:

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Klebsiella pneumoniae ATCC 23357

Estas dos cepas pertenecen a la Bacterioteca de la Cátedra de Microbiologí­a.

Streptococcus agalactiae, cepa de referencia del Hospital Clí­nico Universitario (HCU).

Aislamiento e identificación de las cepas de K. pneumoniae, S. aureus y S. agalactiae

Las muestras fueron sembradas por estriación en placas con agar base sangre (Oxoid), suplementado con 5% de sangre humana, con agar chocolate, agar base GC suplementado con Vitox (oxoid), seguidamente se incubaron a 37ºC, en atmósfera de 5 a 10% de CO₂ durante 18 a 24 horas y en agar Cled (Oxoid) incubado a 37ºC, en atmósfera normal durante 18 a 24 horas ⁽²³⁾. Todas las cepas pertenecientes a los géneros en estudio fueron identificadas sobre la base de caracterí­sticas fenotí­picas convencionales aceptadas para los aislados clí­nicos. Para el aislamiento e identificación de K. pneumoniae, se seleccionaron colonias con aspecto mucoso, grandes, convexas, se les realizó la coloración de Gram y las pruebas bioquí­micas siguientes: Determinación de la utilización de los sustratos urea, lisina, citrato, glucosa, lactosa, sucrosa, pruebas de motilidad en preparaciones al fresco y en agares semisólidos como manitol-motilidad y determinación de la producción de indol en los medios motilidad-indol-ornitina ⁽²⁴⁾.

En el caso de Staphylococcus aureus, se seleccionaron de las placas colonias medianas con pigmento amarillo-anaranjado. Seguidamente, se le realizó la coloración de Gram y las siguientes pruebas: Crecimiento en los medios de Chapman, OF-glucosa, determinación de la sí­ntesis de las enzimas catalasa, DNasa, estafilocoagulasa, fosfatasa alcalina así­ como su comportamiento frente a la polimixina B y a la novobiocina ⁽²⁵⁾.

En el caso de Streptococcus agalactiae, se seleccionaron colonias pequeñas, translúcidas con un pequeño halo de β- hemolisis. Seguidamente se le realizó la coloración de Gram y las siguientes pruebas: Determinación de la producción de la enzima catalasa, capacidad para hidrolizar el hipurato y la producción de la proteí­na extracelular difusible o factor CAMP ⁽²⁶⁾.

Este procedimiento de identificación descrito se aplicó también a las cepas controles.

Cultivo en medio lí­quido de las cepas de K. pneumoniae, S. aureus y S. agalactiae

Posteriormente a la identificación de las cepas, bajo campana de flujo laminar (Labconco, Purifier ^TM Class II Safety CABINET), se tomaron 4 ó 5 colonias de cada cepa, para realizar una suspensión en solución salina estéril (0,85%) con turbidez compatible con el patrón de McFarland Nº 0,5 (1,5 X 10⁸ UFC/ml) ⁽²⁷⁾, de esta suspensión celular, se extrajo 1,0 ml y se agregó en un tubo conteniendo 5 ml de caldo infusión-cerebro-corazón (Oxoid). Los tubos se incubaron a 35-37º C durante 18 a 24 horas.

Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear protónica (⁺HRMN).

Transcurrido este tiempo, de cada cultivo lí­quido se tomó una alí­cuota de 0.7 ml, se transfirió estérilmente a la celda ⁺RMN (5mm, diámetro externo) y se le agregó 0,05 ml de óxido de deuterio. De la misma manera se procedió con una alí­cuota estéril de caldo infusión-cerebro-corazón (CICC). A cada cultivo se le comprobó la pureza, mediante el cultivo en placas de agar base sangre (Oxoid), suplementado con 5% de sangre humana, e incubados a 37ºC, en atmósfera de 5 a 10% de CO₂ durante 18 a 24.

Las celdas RMN conteniendo los cultivos fueron inmediatamente transportadas a 4° C hasta el Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear en el Departamento de Quí­mica del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientí­ficas (IVIC). Las medidas de ⁺HRMN fueron realizadas a 37 ºC en un Bruker AM-300 MHz. Los espectros en una dimensión (1D) fueron adquiridos con los siguientes parámetros: frecuencia, 300,13 MHz; ángulo de pulso de 30º para un pulso de 90 º de 10 µs, tiempo de repetición 3S, puntos de datos: 32 K, número de barridos 128, amplitud espectral 20 ppm, tiempo total de adquisición 10 a 20 min. El campo se bloqueó con la señal de Deuterio del solvente D₂O. La supresión del agua se realizó por presaturación de la misma.