Aislamiento e Identificación de los acinos pancreáticos

Una vez aplicado el método descrito para la obtención de acinos, éstos fueron identificados mediante microscopía de contraste a 40x. La concentración obtenida de la suspensión de acinos pancreáticos aislados de ratón fue de 3x 10⁴ células/ ml y el número de células acinares en cada pozo fue 2,7x 10³ células.

Figura 1. Identificación de las células acinares aisladas de pancreata de ratón NIH. Microscopio de contraste 40x, sin tinción. Escala aproximada de la barra (10μm)

La viabilidad celular se determinó en cada punto de la curva dosis respuesta. El porcentaje de viabilidad obtenido fue 90,6±3,14%, sólo se observó una disminución significativa en este parámetro cuando se comparó el control vs Cch 30μM más TzV 128,5 μg/mL (figura 2).

Figura 2. Porcentaje de Viabilidad celular en controles y bajo los diferentes tratamientos. Los resultados se expresan como el porcentaje de viabilidad, cada barra representa el promedio ± EE n=5 experimentos individuales por duplicado. ANOVA (F=6.534).

Efecto de la Cch y el TzV sobre la secreción de proteínas totales al medio extracelular en acinos pancreáticos aislados

Los resultados obtenidos en este estudio muestran que la Cch produce un incremento de la secreción de proteínas en acinos pancreáticos aislados que siguen una tendencia lineal, la cual se hace significativa a partir de 0,91 μg/ml con respecto al basal. Así mismo, el TzV también posee un efecto que depende de la concentración a partir de 2,5μg/mL y resultó significativo a partir de 128,5 μg/ml (ver figura 3).

Figura 3. Secreción de Proteínas de los acinos pancreáticos aislados inducida por Cch y TzV. Cada punto representa el promedio ± EE de n=3 experimentos individuales por duplicado. Para Cch: r=0,87; P=0,0021 y para TzV: r=0,84; P=0,0006.

Efecto de la Cch y el TzV sobre la secreción de enzimas (amilasa y tripsina) al medio extracelular en acinos pancreáticos aislados 8

La figura 4 muestra la cinética dosis respuesta de la liberación de amilasa a concentraciones crecientes de Cch y TzV, donde se puede observar que la liberación de amilasa es concentración dependiente tanto para la Cch como para el TzV.

Figura 4. Efecto de Cch y TzV sobre la actividad de amilasa secretada. Cada punto representa el promedio ± EE, n=5 experimentos individuales por duplicado. Valor basal (1,97U/mg de proteína). Ajuste de la curva (líneas punteadas) r=0,98 para Cch y r=0,94 para TzV. LogCE50= 0,56 para Cch y Log CE50=0,54 para TzV. Emax=7,74 para Cch y Emax=6,94 para TzV.

Con relación al efecto de la Cch sobre la actividad específica acumulada de la tripsina se observó que ésta es dependiente de su concentración como se muestra en la figura 5. El efecto de TzV sobre la actividad específica acumulada de tripsina no es dependiente de la concentración de veneno ya que un incremento en la concentración de veneno no produce variaciones significativas en la actividad de la enzima (ver figura 5).

Al combinar el análogo del secretagogo endógeno más el veneno (Cch10μM+TzV 128,5 μg/ml) se observa la máxima actividad de tripsina (figura 5, línea punteada).

Figura 5. Efecto de la administración de Cch, TzV y su combinación sobre la actividad especifica acumulada de tripsina. Cada punto representa el promedio ± EE de la actividad acumulada de tripsina. n=3 experimentos por duplicado. Control-basal=47,03U/mg de proteína. r=0,99 para Cch y r=0,94 para TzV. CE50= 2,88 para Cch y CE50 =1,10 para TzV. **P<0,01. La línea punteada indica la actividad específica acumulada de tripsina cuando se realizó la combinación Cch 10μM y TzV 128,5 μg/ml.

En la figura 6 se muestran los efectos máximos en porcentaje sobre el basal de los tratamientos administrados. Los parámetros estandarizados fueron la secreción de proteínas, la actividad de amilasa y de tripsina. Se puede observar que la Cch y el veneno superan significativamente el valor basal y la combinación de Cch + TzV es significativamente superior a la de los tratamientos individuales, lo que sugiere un efecto potenciador de dicha combinación. Así mismo la secreción de proteínas totales liberadas al medio extracelular sigue el mismo comportamiento del componente enzimático.

Figura 6. Efecto de Cch, TzV y la combinación sobre la actividad enzimática y la secreción de proteínas estandarizada del porcentaje sobre el basal al medio extracelular (% sobre el basal). Cada barra representa el promedio ±EE, n=3 experimentos por duplicado. Anova F=7.190. *P<0,05. r=0,99 para Cch y r=0,94 para TzV.