Muestra

La población estudiada está conformada por 51 cepas de Enterobacterias productoras de BLEE, recolectadas entre los años 2002-2004. La distribución de las mismas fue la siguiente: K. pneumoniae (25), E. coli (16), P. mirabilis (2), Enterobacter spp. (1), E. cloacae (3), C. diversus (1), C. freundii (1), Salmonella spp. (1) y S. marcescens (1). Fueron aisladas de diversas muestras y provenientes de diferentes servicios de hospitalización, de los siguientes centros hospitalarios del área Metropolitana de Caracas: Hospital ¨José Gregorio Hernández¨ (23), Policlínica Metropolitana (6), Maternidad ¨Concepción Palacios¨ (5), Hospital Militar ¨Dr. Carlos Arvelo¨ (2), Instituto Clínico ¨La Floresta¨ (2), Hospital de Clínicas Caracas (12), Hospital de Niños ¨J. M. de los Ríos? (1).

Ensayos de susceptibilidad antimicrobiana y detección fenotípica de b-lactamasas de Espectro Expandido (BLEE)

Se llevo a cabo la metodología de Kirby-Bauer recomendada por la NCCLS 2004. Se determinó el perfil de resistencia a los siguientes antibióticos: amikacina (Ak), gentamicina (Ge), ciprofloxacina (Cip), trimetropin/sulfametoxazol (Sxt), piperacilina/tazobactam (Tzp), amoxicilina/clavulánico (Amc), cefoxitin (Fox), aztreonam (Atm), ceftazidime (Caz), cefotaxime (Ctx), cefepime (Fep), meropenem (Mem), imipenem (Imp).

La detección fenotípica de BLEE, se realizó mediante el método de doble difusión en disco¹⁰ y por el recomendado por la NCCLS 2004.

Los controles de calidad utilizados fueron: E. coli ATCC 25922-ATCC 35218 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC-700603.

Detección molecular de BLEE mediante ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Tabla 1. Secuencia de Iniciadores para Tipificación de BLEE.

El protocolo utilizado para la reacción de PCR fue el siguiente: 4 min a 95 ºC, 30 ciclos de 1 min a 94ºC (desnaturalización), 1 min y 30 seg a 55ºC (alineamiento), 1 min a 72ºC (polimerización), y una extensión final de 10 min a 75ºC.  Los reactivos y volúmenes utilizados están enumerados en la Tabla 2.

Tabla 2. Reactivos y volúmenes utilizados en la reacción de PCR.

* Solución 10 mM para adenina, timina, citosina y guanina

** Mezcla: 0,2 ml de Taq Polimerasa y 16,3 ml de agua

Los productos de amplificación fueron visualizados mediante  electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. Se utilizó el marcador de PM ladder 100 pb. El control positivo para BLEE tipo SHV: K. pneumoniae M-1740. Para BLEE tipo TEM: E. coli M-3195. Para BLEE tipo CTX-M: K. pneumoniae M-1803. El control negativo: E. coli ATCC 25922. Todas las cepas controles positivos fueron donadas por el Dr. Marcelo Galas del Instituto de Enfermedades Infecciosas-ANLIS. Buenos Aires-Argentina.

La caracterización de BLEE tipo SHV se llevó a cabo mediante ensayos de PCR-RFLP (reacción en cadena de la polimerasa y análisis de polimorfismos mediante el uso de enzimas de restricción).

Una vez obtenido el producto de amplificación del gen codificante para  β-lactamasas tipo SHV, se procedió a cortar el ADN con la enzima de restricción Nhe I. Esta enzima corta una secuencia especifica de nucleótidos generada en la posición 238 del gen, producto del cambio mutacional G----A, esta mutación es característica de varias BLEE derivadas de SHV-1 (SHV-2, SHV-5, SHV-12). De esta manera se logró determinar que el producto de amplificación correspondía a una BLEE derivada de SHV-1.

Transferencia plasmídica de genes que codifican para BLEE y de Integrones clase I

La transferencia de plásmidos que codifican para BLEE y que portan genes estructurales correspondientes a Integrones clase I, se llevó a cabo mediante ensayos de Conjugación Bacteriana en medio sólido. Las cepas donantes corresponden a un numero de 36 cepas de Enterobacterias que poseían los marcadores fenotípicos adecuados para dicho ensayo, es decir, presentaban sensibilidad a Rifampicina y/o Ácido nalidíxico. La cepa receptora de plásmidos conjugativos fue la Escherichia coli K-12 NCTC50170, RC-711 rif (donada por el CVCM). La selección de cepas transconjugantes fue realizada en placas de medio agar Luria-Bertani (agar LB) suplementadas con rifampicina (40 μg/mL) y ampicilina (30 μg/mL)  y una segunda placa de agar LB suplementadas con rifampicina (40 μg/mL) y ceftazidime ó cefotaxime (10 μg/mL).

Aislamiento plasmídico

Para el aislamiento de plásmidos se utilizó el método de lisis alcalina, empleando polietilenglicol y cloruro de litio⁴. En el caso de cepas transconjugantes se utilizó la técnica a mediana escala y para las cepas donantes a pequeña escala, ambos cultivos con 24 horas de crecimiento en agitación a 37°C.

El aislamiento plasmídico fue visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,6%. Se utilizó el marcador de peso molecular  del bacteriófago Lambda Hind III.

Detección de Integrones clase I mediante ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Se utilizaron iniciadores (Tabla 3) que reconocen secuencias específicas de la integrasa clase 1 (Figura 2), la detección de la integrasa se llevó a cabo a partir de las células bacterianas de las Enterobacterias y sus correspondientes transconjugantes y del ADN  plasmídico aislado, según el  protocolo de Di Conza y col. (2002)⁷. Los volúmenes de reactivos fueron similares a los usados en el PCR de identificación de BLEE.