Detección fenotípica y molecular de BLEE

Mediante el análisis de los niveles de resistencia (CIMs) para las cefalosporinas de espectro expandido, se evidenció que el 54.9% de las cepas productoras de BLEE muestran una mayor actividad de tipo ceftazidimasa. Mientras que solo un 23.5% de las cepas estudiadas mostró una fuerte actividad hidrolítica para el cefotaxime y valores de resistencia o susceptibilidad intermedia para el cefepime. Igualmente hay que señalar que 7 (13.7%) cepas poseen un patrón fenotípico característico de ambos tipos de BLEE, es decir, actividad marcada frente a ceftazidime y cefotaxime (Tabla 4).

Los ensayos de detección molecular mediante PCR revelaron que el mayor porcentaje de BLEE circulantes en estas cepas corresponde a la familia SHV (presuntamente SHV-5) con un 60.78% (Figura 3, Tabla 4). Mientras que un 15.68% de las cepas amplificaron con los iniciadores específicos para genes de la familia CTX-M del grupo 2 (Figura 4, Tabla 4). Así mismo se encontró que 4 (7,8%) cepas presentan genes que codifican para las BLEE tipo SHV y CTX-M concomitantemente. Por otra parte, hubo resultados de amplificación positiva para genes de la familia TEM, pero siempre en asociación con genes de BLEE tipo SHV (Tabla 4).

Tabla 4. Caracterización de BLEE en cepas de Enterobacterias aisladas de diferentes centros hospitalarios del área Metropolitana.

Ensayos de transferencia plasmídica de genes que codifican para BLEE y de Integrones clase I.

De las 51 cepas de Enterobacterias se conjugaron 36 (69%), debido a que estas poseían los marcadores fenotípicos adecuados para el ensayo. De estas 36 Enterobacterias se obtuvieron 29 cepas transconjugantes, es decir 81% de las cepas transfirieron material plasmídico a la cepa receptora (E. coli K-12). A las 21 cepas restantes, se les realizó aislamiento plasmídico de manera directa, y se evidencio mediante PCR la presencia de genes de BLEE tipo SHV y CTX-M, de la misma manera se determinó la presencia de integrones clase 1 sobre ADN plasmídico.

En todas las transconjugantes obtenidas mediante ensayos de conjugación, se detecto fenotípicamente la producción de BLEE, de la misma manera se identifico el tipo de BLEE por PCR, en las transconjugantes y en todos los casos se identifico el mismo tipo de BLEE que portaba la Enterobacteria donante. Hay que destacar, que se observó la adquisición de resistencia por parte de las transconjugantes al cefoxitin en un 7%.

Aislamientos plasmídicos

El 100% de los aislamientos plasmídicos obtenidos en cepas transconjugantes, presentan una banda con un peso molecular en el rango de 25000 pb. Igualmente se observa que en más del 80% de las cepas existe una banda con un peso molecular superior a los 50000 pb. Por otra parte se evidencia que un 44.8% de las cepas poseen dos bandas con un peso molecular más bajo, de aproximadamente 3500 pb y 2500 pb respectivamente (Figura 5).

En los aislamientos plasmídicos de las cepas donantes se observa una banda con un peso molecular de aproximadamente 25000 pb, similar a la observada en las cepas transconjugantes. Menos del 5% de las cepas donantes posee una banda por debajo de los 2000 pb, que no se observa en la electroforesis de las transconjugantes. En el resto de las cepas el patrón de aislamiento plasmídico es similar tanto en cepas donantes como en sus respectivas transconjugantes (Figura 5).

Detección de Integrones clase I

Se realizó la detección de Integrones clase I sobre las 51 cepas de Enterobacterias y las 29 transconjugantes obtenidas. Un total de 14 (27.5%) cepas de Enterobacterias amplificaron con iniciadores específicos para el gen de la integrasa clase 1, este porcentaje incluye, K. pneumoniae (7), E. coli (6) y C. freundii (1) (Tabla 5).

De las 14 cepas que resultaron positivas para integrones clase 1, nueve (64.3%) cepas provienen del Hospital ¨Dr. José Gregorio Hernández¨, cuatro (28.6%) cepas del Hospital de Clínicas Caracas y una (7.2%) cepa de la Policlínica Metropolitana.

Tabla 5. Detección de Integrones Clase 1 mediante ensayos de PCR en aislados provenientes de diferentes centros hospitalarios

En la corrida anterior, se muestra en el carril 1 el marcador de peso molecular, en el carril 2 el producto de amplificación de 371 pb del control positivo (E. coli K-12) de ADN bacteriano. En el carril 3, se observa el producto de amplificación de 927 pb del control positivo (E. coli HUC-0117) de integrones clase 1¹⁴. En los carriles 4 y 5 se observa la amplificación de cepas de Escherichia coli, CC-16695 y CC-3453, respectivamente. En los carriles 6 y 7 se observan dos cepas de Klebsiella pneumoniae, ambas provenientes del Hospital ¨Dr. José Gregorio Hernández¨.