Microbiología
Detección de integrones clase I en cepas de enterobacterias productoras de β- lactamasas de espectro expandidotipo SHV y CTX-M grupo- 2
Resultados
Detección fenotípica y molecular de BLEE
Mediante el análisis de los niveles de resistencia (CIMs) para las cefalosporinas de espectro expandido, se evidenció que el 54.9% de las cepas productoras de BLEE muestran una mayor actividad de tipo ceftazidimasa. Mientras que solo un 23.5% de las cepas estudiadas mostró una fuerte actividad hidrolítica para el cefotaxime y valores de resistencia o susceptibilidad intermedia para el cefepime. Igualmente hay que señalar que 7 (13.7%) cepas poseen un patrón fenotípico característico de ambos tipos de BLEE, es decir, actividad marcada frente a ceftazidime y cefotaxime (Tabla 4).
Los ensayos de detección molecular mediante PCR revelaron que el mayor porcentaje de BLEE circulantes en estas cepas corresponde a la familia SHV (presuntamente SHV-5) con un 60.78% (Figura 3, Tabla 4). Mientras que un 15.68% de las cepas amplificaron con los iniciadores específicos para genes de la familia CTX-M del grupo 2 (Figura 4, Tabla 4). Así mismo se encontró que 4 (7,8%) cepas presentan genes que codifican para las BLEE tipo SHV y CTX-M concomitantemente. Por otra parte, hubo resultados de amplificación positiva para genes de la familia TEM, pero siempre en asociación con genes de BLEE tipo SHV (Tabla 4).
Tabla 4. Caracterización de BLEE en cepas de Enterobacterias aisladas de diferentes centros hospitalarios del área Metropolitana.
|
ACTIVIDAD FENOTÍPICA |
TIPIFICACIÓN MOLECULAR |
Microorganismos |
Ceftazidimasa N(%) |
Cefotaximasa N(%) |
Ambas N(%) |
Sin Act
N(%) |
SHV
N(%) |
CTX-M
N(%) |
SHV + CTX-M
N(%) |
SHV-TEM
N(%) |
Klebsiella pneumoniae |
16 (31.4) |
4 (7.8) |
4 (7.8) |
1 (1.96) |
19 (37.3) |
2 (3.9) |
3 (5.9) |
1 (1.96) |
Escherichia coli |
7 (13.7) |
5 (9.8) |
2 (3.9) |
2 (3.9) |
10 (19.6) |
3 (5.9) |
1 (1.96) |
2 (3.9) |
Enterobacter spp. |
1 (2.0) |
- |
- |
- |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
Enterobacter cloacae |
1 (2.0) |
- |
1 (1.96) |
1 (1.96) |
3 (5.9) |
- |
- |
- |
Proteus mirabilis |
- |
2 (3.9) |
- |
- |
- |
2 (3.9) |
- |
- |
Citrobacter diversus |
- |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
1 (1.96) |
- |
- |
Citrobacter freundii |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1 (1.96) |
Salmonella spp. |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
Serratia marscensces |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
TOTAL |
28 (54.9) |
12 (23.5) |
7 (13.7) |
4 (7.8) |
35 (68.6) |
8 (15.7) |
4 (7.8) |
4 (7.8) |
Ensayos de transferencia plasmídica de genes que codifican para BLEE y de Integrones clase I.
De las 51 cepas de Enterobacterias se conjugaron 36 (69%), debido a que estas poseían los marcadores fenotípicos adecuados para el ensayo. De estas 36 Enterobacterias se obtuvieron 29 cepas transconjugantes, es decir 81% de las cepas transfirieron material plasmídico a la cepa receptora (E. coli K-12). A las 21 cepas restantes, se les realizó aislamiento plasmídico de manera directa, y se evidencio mediante PCR la presencia de genes de BLEE tipo SHV y CTX-M, de la misma manera se determinó la presencia de integrones clase 1 sobre ADN plasmídico.
En todas las transconjugantes obtenidas mediante ensayos de conjugación, se detecto fenotípicamente la producción de BLEE, de la misma manera se identifico el tipo de BLEE por PCR, en las transconjugantes y en todos los casos se identifico el mismo tipo de BLEE que portaba la Enterobacteria donante. Hay que destacar, que se observó la adquisición de resistencia por parte de las transconjugantes al cefoxitin en un 7%.
Aislamientos plasmídicos
El 100% de los aislamientos plasmídicos obtenidos en cepas transconjugantes, presentan una banda con un peso molecular en el rango de 25000 pb. Igualmente se observa que en más del 80% de las cepas existe una banda con un peso molecular superior a los 50000 pb. Por otra parte se evidencia que un 44.8% de las cepas poseen dos bandas con un peso molecular más bajo, de aproximadamente 3500 pb y 2500 pb respectivamente (Figura 5).
En los aislamientos plasmídicos de las cepas donantes se observa una banda con un peso molecular de aproximadamente 25000 pb, similar a la observada en las cepas transconjugantes. Menos del 5% de las cepas donantes posee una banda por debajo de los 2000 pb, que no se observa en la electroforesis de las transconjugantes. En el resto de las cepas el patrón de aislamiento plasmídico es similar tanto en cepas donantes como en sus respectivas transconjugantes (Figura 5).
Detección de Integrones clase I
Se realizó la detección de Integrones clase I sobre las 51 cepas de Enterobacterias y las 29 transconjugantes obtenidas. Un total de 14 (27.5%) cepas de Enterobacterias amplificaron con iniciadores específicos para el gen de la integrasa clase 1, este porcentaje incluye, K. pneumoniae (7), E. coli (6) y C. freundii (1) (Tabla 5).
De las 14 cepas que resultaron positivas para integrones clase 1, nueve (64.3%) cepas provienen del Hospital ¨Dr. José Gregorio Hernández¨, cuatro (28.6%) cepas del Hospital de Clínicas Caracas y una (7.2%) cepa de la Policlínica Metropolitana.
Tabla 5. Detección de Integrones Clase 1 mediante ensayos de PCR en aislados provenientes de diferentes centros hospitalarios
Microorganismos |
Cepas
N (%) |
PCR Int 1
N (%) |
Hospital
JGH
N (%) |
Hospital
CC
N (%) |
Policlínica
Metropolitana
N (%) |
Klebsiella pneumoniae |
25 (49.0) |
7 (13.7) |
5 (9.8) |
1 (1.96) |
1 (1.96) |
Escherichia coli |
16 (31.4) |
6 (11.8) |
3 (5.9) |
3 (5.9) |
- |
Citrobacter freundii |
1 (1.96) |
1 (1.96) |
1 (1.96) |
- |
- |
Citrobacter diversus |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
- |
Enterobacter cloacae |
3 (5.9) |
- |
- |
- |
- |
Enterobacter spp. |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
- |
Serratia marcescens |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
- |
Proteus mirabilis |
2 (3.9) |
- |
- |
- |
- |
Salmonella spp. |
1 (1.96) |
- |
- |
- |
- |
Total |
51 (100) |
14 (27.5) |
9 (17.6) |
4 (7.9) |
1 (1.96) |
Hospital JGH: Hospital José Gregorio Hernández (Magallanes de Catia), Hospital CC: Hospital de Clínicas Caracas. |
Figura 6. Productos de amplificación de 927 pb en células donantes utilizando iniciadores para genes de la integrasa clase I en gel de agarosa al 1.5%.
Carriles: 1) DNA ladder 100pb. 2) Control positivo (ADN bacteriano). 3) Control positivo (Integrón Clase 1). 4) CC-16695. 5) CC-3453. 6) JGH-0370. 7) JGH-0676. 8) Control negativo (sin ADN). |
A continuación, se observan productos de amplificación con células completas en el rango de 900 pb, la misma se correlaciona con el tamaño estimado teóricamente, mediante la búsqueda de la secuencia de la integrasa clase I en el Gen Bank, que es de 927 pb (Figura 6).
En la corrida anterior, se muestra en el carril 1 el marcador de peso molecular, en el carril 2 el producto de amplificación de 371 pb del control positivo (E. coli K-12) de ADN bacteriano. En el carril 3, se observa el producto de amplificación de 927 pb del control positivo (E. coli HUC-0117) de integrones clase 114. En los carriles 4 y 5 se observa la amplificación de cepas de Escherichia coli, CC-16695 y CC-3453, respectivamente. En los carriles 6 y 7 se observan dos cepas de Klebsiella pneumoniae, ambas provenientes del Hospital ¨Dr. José Gregorio Hernández¨.
En la Figura 7, se muestra en el carril 3, el producto de amplificación de una cepa de Citrobacter freundii proveniente del Hospital ¨Dr. José Gregorio Hernández¨, en el carril 4 se muestra otra cepa de E. coli y por último, en los carriles siguientes (5 al 7) cepas de K. pneumoniae, todas provenientes del mismo centro hospitalario.
De las 14 cepas de Enterobacterias, en las cuales hubo amplificación para genes de la integrasa clase 1, sólo nueve de ellas poseían cepas transconjugantes y a este grupo se les realizó PCR, para evidenciar la presencia de integrones. La amplificación para genes de la integrasa clase I, fue positiva para las nueves cepas transconjugantes obtenidas por conjugación (Figura 8).
Los datos obtenidos indican que de las 14 cepas portadoras de integrones clase I, el 32.4% de las mismas producen BLEE de tipo SHV y un 44.4% producen enzimas de la familia CTX-M (Tabla 6).
Microorganismos |
BLEE SHV |
Integrón Clase 1 |
BLEE CTX-M |
Integrón Clase 1 |
|
N (%) |
N (%) |
N (%) |
N (%) |
Klebsiella pneumoniae |
23 (62.2) |
7 (18.9) |
5 (55.6) |
2 (22.2) |
Eschericia coli |
13 (35.1) |
4 (10.8) |
4 (44.4) |
2 (22.2) |
Citrobacter freundii |
1 (2.7) |
1 (2.7) |
----- |
------ |
TOTAL |
37 (100) |
12 (32.4) |
9 (100) |
4 (44.4) |
Tabla 6. Caracterización de BLEE en cepas de Enterobacterias positivas para Integrasa clase 1.
|