El estudio está
enmarcado en una investigación de tipo descriptivo correlacional, de corte
transversal, prospectivo y con un diseño no experimental (19,20). La
población estuvo representada por 141 aislados de Staphylococcus aureus, de las cuales 64 provenían de portadores
asintomáticos y 77 de procedencia infecciosa, estos aislados fueron
recolectados posterior a la permisología otorgada por el Laboratorio de
Diagnóstico Bacteriológico del Departamento de Microbiología de la Universidad de
Carabobo y por el Laboratorio Clínico La Viña (Centro Médico Privado, Valencia, Venezuela)
respectivamente, entre mayo-noviembre del año 2013, cumpliéndose con el
requisito del consentimiento informado de los pacientes involucrados. La
muestra estuvo constituida por el total de las cepas que conformó la población.
Una vez
recolectados los aislados de S. aureus provenientes
de portadores asintomáticos y de procesos infecciosos, se realizaron las pruebas
bioquímicas convencionales para confirmar su identificación como lo describe la
literatura (21). Posteriormente se conservaron en la bacterioteca hasta
agotar el tiempo establecido de recolección, seguidamente se procedió a repicar
las bacterias almacenadas en caldo BHI (Infusión Cerebro Corazón) y luego en
agar manitol salado, con la finalidad de obtener cepas frescas o recién
cultivadas.
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
De colonias aisladas, se preparó una suspensión bacteriana ajustada
al patrón 0,5% Mc Farland equivalente a 1.5 x 108UFC/mL,
en solución salina fisiológica con el cual se ejecutó
la prueba de susceptibilidad antimicrobiana por el método cualitativo Kirby
Bauer. Se usaron discos de sensibilidad marca BD BBLR de oxacilina
(OX: 1 µg) y cefoxitín (FOX: 30 µg), para detectar cepas de S. aureus resistentes a meticilina (SARM),
clindamicina (CC: 2 µg ) y eritromicina (E: 15 µg) teniendo en cuenta la
colocación frente a frente de estos discos para realizar el D-test, con la finalidad
de evidenciar cepas con resistencia a macrólidos y lincosamidas de los
siguientes fenotipo: 1) cMLSB resistencia
constitutiva a E y CC (D-test negativo), 2) MSB resistencia
constitutiva a E y sensible a CC sin achatamiento (D-test negativo) y 3) iMLSB resistencia a E y sensible a CC con achatamiento (D-test positivo),
resistencia exclusiva a lincosamidas por presencia de enzimas
nucleotidiltransferasas (E- Lnu) poco frecuente. Finalmente para la detección
de cepas con resistencia a vancomicina (VRSA) y cepas con resistencia intermedia
a vancomicina (VISA), se utilizó el método de dilución en Agar BHI suplementado
con 6 µL/mL de vancomicina (CMI ≥ 8µL/mL)
y método de dilución en caldo en (CMI ≤ a 4µL/mL). Todas las lecturas se interpretaron según los criterios
establecidos por la CLSI
(Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio) (11,22).
Para evaluar el buen funcionamiento de los discos de antibióticos y
del Agar Muller Hinton se utilizó la cepa de referencia S. aureus ATCC 25923 adquirida en el Centro Venezolano de Colección
de Microorganismos, cuyos halos fueron comparados con los rangos establecidos
por la CLSI. Para
evaluar el agar BHI suplementado con vancomicina se utilizaron las cepas de
referencia Enterococcus faecalis ATCC
29212 y ATCC 51299 (22,23).
Una vez obtenidas las lecturas se
clasificaron las cepas en dos grandes grupos, un primer grupo constituido por
cepas sensibles a todos los antibióticos mencionados y un segundo grupo que
estuvo conformado por cepas resistentes a al menos un antibiótico o más, con
los cuales se realizó la asociación en cuanto a la formación de biopelículas en
ambos grupos.
Cuantificación de la capacidad de
formación de biopelículas
Se efectuó mediante la técnica de microplaca en pozos de
poliestireno (método colorimétrico) descrita por Al-Shuneigat et al. citado en Rojas y col (2012). Se preparó
una suspensión bacteriana ajustada al patrón 0,5% Mc Farland en caldo soya tripticasa. De
esta suspensión se dispensó 20 μL en cada pozo, más 180 μL de caldo soya
tripticasa con glucosa al 0,25% (dilución 1:10) para luego incubar en cámara
húmeda por 24 horas a 37°C.
Pasada la incubación, en cada pozo se realizaron dos lavados con solución
buffer fosfato salino estéril (PBS, pH
7,2). Se añadieron 200 μL de solución de cristal violeta al 0,01 %
manteniéndose a temperatura ambiente por 30 min y posteriormente se realizaron
dos nuevos lavados con solución PBS. Seguido a esto se adicionó 200 μL de etanol al 95% para
solubilizar el colorante adherido a las paredes, cuantificándose su densidad
óptica (DO) como una estimación de la capacidad de formación de biopelículas,
la medición se realizó a 490 nm utilizando un lector de micro ELISA (Stat Fax
303 Plus) (24).
Cada aislado se
evaluó por cuadruplicado, incluyendo en cada ensayo ocho pozos sin inocular
interpretándose estos como controles negativos y adicionalmente se introdujeron
ocho pozos con aislados conocidos por sus altas capacidades de formación de
biopelículas tomados de la bacterioteca del Laboratorio de Diagnóstico
Bacteriológico (cuatro pozos para Klebsiella
pneumoniae y cuatro pozos para Pseudomonas
aeruginosa), estos últimos se interpretaron como controles positivos.
Para la clasificación de cada aislado, en cuanto a su capacidad de
formación de biopelículas, se utilizaron ecuaciones matemáticas que contiene la DO de los pozos control
negativo como lo cita Rojas y col, adicionándose una variante que
incluye la DO de los controles positivos tal como sigue: se calculó la media
aritmética () de las DO obtenidas a 490nm de los controles
positivos y de los controles negativos para ser utilizados en las siguientes
tres fórmulas:
VM: DOc (+) – DOc (-)/2
PC1: VM – DOc(-)/2 + DOc (-)
PC2: DOc(+) –VM/2 + VM
Donde
las siglas significan:
VM: valor medio; DOc (+):() de las densidades óptica
a 490 nm de los controles positivos; DOc (-): () de las densidades
ópticas a 490 nm de los controles negativos; PC1: primer punto de corte; PC2:segundo punto de corte.
A partir de los
valores de VM, PC1 y PC2 obtenidos se establecieron los rangos para la
clasificación de la capacidad de formación de biopelículas en cuatro
categorías: fuerte, moderada, débil y no formadora. Interpretado de la
siguiente manera: serán no formadoras cuando los valores se ubiquen entre la DOc
(-) hasta cifras ≤ PC1, débilmente formadora cuando los valores se encuentren
> PC1 ≤ VM, moderadamente formadoras cuando los valores sean > VM ≤ PC2 y
fuertemente formadora con valores > PC2.
Análisis de los datos
El análisis
descriptivo de los datos se expresó mediante tablas y gráficos de barra en
porcentaje. Por otra parte, la asociación de la capacidad de formación de
biopelículas con la susceptibilidad antimicrobiana y con la procedencia clínica
se efectuó mediante la prueba Chi2 de Pearson, con un nivel de confianza de 95 %.