Se utilizó un diseño cuasi experimental, de tipo descriptivo de corte transversal.

Extractos hidrosolubles de propóleos   

Se utilizó un extracto hidrosoluble concentrado (100%) de propóleo producido por abejas con aguijón Apis mellífera y un extracto hidrosoluble concentrado (100%) de propóleo producidas por abejas sin aguijón Trigonas sp. ambas recolectadas y elaboradas artesanalmente en San Antonio del Táchira, Estado Táchira, Latitud 07°48′52″N, Longitud 72°26′35″W, Venezuela.

Paralelamente se utilizó un extracto etanólico de propóleo (EEP) al 50% de abejas Apis mellífera elaborado en el mismo apiario, con la finalidad de tener un punto de comparación del efecto inhibitorio.

Cepas en estudio

Se trabajó con las siguientes cepas American Type Culture Collection (ATCC): Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, obtenidas del Centro Venezolano de Colección de Microorganismos (CVCM) y conservadas en el cepario del Laboratorio de Diagnóstico Bacteriológico de la Universidad de Carabobo, Venezuela.

Reactivación de las cepas bacterianas

A fin de reactivar las cepas (ATCC) de Escherichia coli y Staphylococcus aureus conservadas en el cepario, se inocularon en caldo infusión cerebro corazón (BHI) marca BD BBL™, se incubaron durante 24 horas a 37ºC para su reproducción. Luego se sembraron en agar sangre.

Preparación de las suspensiones bacterianas

Del agar sangre se tomaron colonias aisladas suspendiéndolas en caldos BHI hasta alcanzar la turbidez del patrón 0,5 % Mc Farland equivalente a 1,5 x 10⁸ UFC.

Preparación de las diluciones dobles seriadas

Se utilizó el método de macrodilución en tubos la cual se describe a continuación siguiendo las especificaciones de Gil y colaboradores en el año 2012 ⁽¹²⁾, con algunas modificaciones: se dispusieron 10 tubos 12 x 75 para cada propóleo y por cada bacteria a evaluar. Las diluciones fueron dobles seriadas. Cada tubo contenía 500 µL de caldo Müeller Hinton marca BD BBL™ menos el primero que correspondió al EHP puro, al tubo 2 hasta el tubo 8 se realizaron las diluciones dobles seriadas 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, de esta manera las concentraciones obtenidas desde el tubo 1 al 8 fueron: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%. El tubo 9 correspondió al control de viabilidad de la bacteria (control positivo) y el tubo 10 correspondió al control de esterilidad del propóleos (control negativo). Una vez realizadas las diluciones se procedió a inocular cada tubo menos el tubo 12 con 50 µL de la suspensión bacteriana de E. coli y S. aureus, correspondiente a cada serie al 0,5% de turbidez Mc Farland. Se incubaronpor 24 horas a 37 ºC ⁽¹²⁾.

Determinación de la actividad bacteriostática y bactericida

Siguiendo el protocolo de Gil y colaboradores 2012 ⁽¹²⁾, trascurrido el tiempo de exposición de las bacterias con las distintas concentraciones de cada propóleo, se procedió a tomar 10 μL de cada tubo para sembrarlo en placas de BHI, utilizando la técnica de siembra en superficie con espátula de Drigalski, así mismo también se tomó con asa calibrada 10 μL de cada tubo y se inoculó en caldo BHI. Ambos procedimientos se incubaron durante 24 a 48 horas a 37ºC. Posteriormente, se observó si hubo o no crecimiento del microorganismo tanto en las placas como en los caldos, determinando de esta manera las diluciones en la que se consigue la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) respectivamente ⁽¹²⁾.

Controles utilizados durante el desarrollo de la metodología

En cada ensayo se utilizó un control de viabilidad, el cual garantiza que el microorganismo es capaz de reproducirse en el agar y en el caldo BHI, también se utilizó un control de esterilidad con la finalidad de garantizar que los propóleos no estuviesen contaminados. Adicionalmente los tubos y en las placas donde se observó crecimiento bacteriano se realizó tinción de Gram y las pruebas bioquímicas convencionales para su identificación, con la finalidad de confirmar si se trata de las bacterias utilizadas o de una posible contaminación.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza de un factor con 3 niveles a través de la prueba no paramétrica ANOVAUnivariante con el fin de contrastar si existen diferencias entre las medias de cada nivel. Posteriormente se realizaron comparaciones entre los propóleos a través de la prueba deTukeyHSD, para identificar el tratamiento con mayor inhibición con un 99% de nivel de confianza.Se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 19.