Se realizó un muestreo no probabilístico, las
muestras fueron recolectadas en el periodo comprendido desde enero 2014 a enero
2015, un total de 150 muestras de heces provenientes de infantes menores a 5
años, que acudieron a dos centros médicos: Servicio autónomo del Hospital
Universitario de la ciudad de Maracaibo (SAHUM) y Seguro Social del municipio
Jesús Enrique Lossada (IVSS).
Los criterios de inclusión fueron: niños
menores de 5 años, de ambos sexos con síndrome diarreico, vacunados o no y que
no hubiesen recibido tratamiento terapéutico. Se seleccionaron 30 muestras de
heces de niños que no presentaron síndrome diarreico y se tomaron como grupo
control.
Se elaboraron encuestas para obtener la
mayor información del paciente, tales como: edad, sexo, procedencia,
manifestaciones clínicas y características de las evacuaciones. Se tomaron en
cuenta las pautas establecidas por la Asociación Médica Mundial (AMM)
contenidas en la declaración de Helsinki(15), así como la previa autorización
por escrito de los padres y representantes. Tanto el consentimiento previo como
la encuesta realizada fueron aprobados por el comité de Bioética del SAHUM y de
la facultad de Medicina.
Las muestras de heces se recolectaron en
envases plásticos de 3 onzas y se transportaron en refrigeración (entre 2 y 8 °C),
luego se almacenaron a temperatura de -20
°C y posteriormente se analizaron en el Laboratorio Regional de Referencia
Virológicas de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia; donde se
evaluaron macroscópicamente en cuanto a consistencia, presencia o ausencia de
moco y sangre.
Para
la detección del antígeno de Rotavirus grupo A en muestras fecales por el
método inmunológico de Aglutinación directa en partículas de látex. se utilizó
un reactivo comercial (Rotaviruses Latex) de Plasmatec Olga ®, el cual está
compuesto por partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo que permiten la
detección del antígeno por aglutinación. El estuche posee todos los reactivos
necesarios para realizar la prueba como son el control positivo (listo para su
uso) y la solución tampón; Así como los implementos necesarios (Láminas de
Aglutinación, pipetas y mezcladores) (16).
Se consideró como un resultado positivo, la
aglutinación macroscópica de las partículas de látex del reactivo. Teniendo
gran significado una aglutinación fuerte; mientras que, el resultado negativo
se evidenció, al observarse una apariencia lechosa sin ninguna agregación
visible de las partículas de látex (16). Cabe destacar que esta técnica tiene
una sensibilidad del 93,7% y altos valores de especificidad; por tanto, fue utilizada
para seleccionar las muestras para su posterior confirmación por técnicas de
biología molecular.
El ARN viral en cada muestra se extrajo
realizando una suspensión de las muestras fecales al 10% (clarificado fecal);
para ello, se agitó vigorosamente en agua libre de nucleasas aproximadamente
0,1 gr de heces sólidas ó 100 ul de heces líquidas, luego fueron centrifugadas a
10.000 rpm por 10 minutos a 4°C, finalmente se guardó la muestra a -20°C hasta
su próximo procesamiento (14).
Extracción de ARN genómico: Para esta etapa
se empleó el sistema comercial de extracción de ARN viral (Qiagen, QIAamp Viral
RNA Mini Kit), siguiendo las indicaciones del fabricante.
Detección del genoma viral: Se realizó
mediante una retrotranscripción (RT), seguida de una PCR, específica para una
región conservada del genoma, específicamente VP4. Para la RT se emplearon
hexámeros aleatorios, los cuales se utilizaron para obtener teóricamente ADN
complementario (ADNc) de todos los ARNs que haya en la mezcla. Implementando
posteriormente PCR para amplificar parte del gen de la proteína de la cápside
externa de Rotavirus: VP4, mediante el empleo de primers específicos (Tabla 1)
y siguiendo los protocolos descritos por Abbasgadezan (17). Para detectar un
fragmento de 211 pb, utilizando como control Positivo una muestra previamente
procesa en el instituto de investigaciones científicas de Venezuela (IVIC-
Caracas) y como control Negativo agua libre de nucleasas.
Tabla 1. Oligonucleótidos iniciadores
utilizados en la Técnica RT-PCR para la detección de Rotavirus (17).
Electroforesis en gel de agarosa: Los
productos obtenidos en la PCR se analizaron en geles de agarosa al 1,5% en
buffer Tris-Borato EDTA (TBE) teñdo con 2μg/μL de bromuro de etidio. La
electroforesis se realizó a 500mA de corriente y a un voltaje de 120 V por 40
minutos. Una vez culminada la electroforesis se observó el gel en un
transiluminador UV Pro. Como marcador de peso molecular se empleó el marcador
de 100 a 1000pb Kb DNA plus de Promega ® (17).
Se
consideraron como muestras positivas aquellas que revelaron la presencia de una
banda de 211pb correspondiente a la región VP4, la muestra se considera
negativa si aparece solamente una banda de 100pb. La reacción se consideró
inhibida cuando no apareció ninguna banda.
Los resultados se expresaron en media ±
desviación estándar, valores absolutos y porcentajes. La normalidad de los
datos fue explorada por la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las variables
cuantitativas fueron comparadas utilizando la técnica estadística U de Mann-Whitney.
Las variables cualitativas se analizaron a través de la prueba de chi cuadrado
de Pearson. Se tomó como índice de confianza el 95% y se consideró como
significativo un valor de probabilidad menor a 0,05 (p<0,05). Para ello, se
empleó el programa estadístico SPSS ® para Windows, versión 21.0.