Cepa: Se utilizó solo una cepa de M. pneumoniae en Caldo PPLO cuya concentración de UFC/ml se desconocía, que fue proporcionada gentilmente por el Dr. Arend Kolk del Royal Tropical Institute, Amsterdam, Holanda. 

Medios de cultivo para M. pneumoniae (7, 9, 12, 13): Para la elaboración de los medios a evaluar se utilizó el caldo para micoplasma (Mycoplasma broth) de la casa comercial OXOID y los suplementos para este se prepararon de manera casera y posteriormente agregados al medio base.  Adicionalmente fue donado por el Dr. Kolk, el medio comercial Bacto PPLO Broth (2,1 gr en 70 ml de agua destilada estéril) y dializado de levadura (10 ml) elaborado de manera casera en el Royal Tropical Institute, Ámsterdam, Holanda. A este último se le agregó suero de caballo (20 ml) y agar (1,5 gr) en nuestro laboratorio. Este medio se utilizó a manera control para el crecimiento de la cepa de M. pneumoniae ya que es el mismo medio base donde fue transportada la cepa.  A continuación se presenta una tabla que muestra las variantes de composición de los medios que fueron evaluados en este trabajo (ver TABLA 1).

A cada uno de los medios se le realizó control de calidad para verificar su esterilidad, incubándolos a 37ºC durante 24 horas y observado posteriormente de manera macroscópica la presencia o no de turbidez en los caldos, o colonias en los medios de agar.

Siembra de medios de cultivo.

Inicialmente, se inocularon 100μl de la cepa de M. pneumoniae en caldo para micoplasmas (CM) y en el medio bifásico para micoplasma (MBM). Cada siete días los líquidos o caldos fueron repicados en agar PPLO, agar para micoplasma (AM) y agar para micoplasmas con inhibidores (AMI). Los medios en caldo fueron incubados en atmósfera de aire a 37ºC y las placas selladas se incubaron en atmósfera de CO₂ a 37ºC. El período de incubación fue de tres (3) semanas, durante las cuales se realizó observación diaria a los mismos para obtener evidencia de crecimiento bacteriano mediante viraje del indicador de pH producto del metabolismo de la glucosa en el caldo y la observación microscópica (objetivo 10X) para evidenciar la presencia de colonias en el agar.

Identificación mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Para confirmar o verificar la especie bacteriana a partir del crecimiento obtenido en los medios de cultivo, se empleó la técnica de PCR según la metodología de Waring y col (2001), empleando como blanco de amplificación el gen de adhesina P1 de M. pneumoniae (número de acceso del GENEBANK AE000002). Bajo estas condiciones de reacción se generan productos de amplificación en el rango de 309 a 339 pb, debido a que los iniciadores empleados en esta reacción, tienen como blanco designado regiones conservadas del gen de adhesina P1 que se encuentran repetidas hasta diez (10) veces dentro del genoma de M. pneumoniae, lo cual incrementa la sensibilidad del ensayo de PCR sobre aquellos métodos típicos que utilizan un blanco no repetido. Este estudio realizado por Waring y col (2001) demostró que la técnica tiene un 100 % de especificidad para amplificar el gen de adhesina P1 de M. pneumoniae. A continuación se describe la metodología aplicada:

1.- Extracción de ADN de Mycoplasma pneumoniae.

Se tomaron 500μl de un caldo de cultivo con viraje de color y luego de centrifugar a 13.000 xg durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 30μl de agua estéril. Se incubó a 95ºC por 15min en baño de agua (14).

2.-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) para M.pneumoniae.

Para la identificación se empleó la amplificación de fragmentos específicos del gen de adhesina P1 de M. pneumoniae con los iniciadores:

MP-F (5’-CCCTCGACCAAGCCAACCTC-3’)

MP-R (5’-TGCGCGTTGTTCTTGTTGGTG-3´).

La mezcla de reacción con un volumen final de 100µl, contiene 1µM de cada primer, 200µM de cada dinucleótido, 10mM de Tris-HCl (8,3), 50mM de KCl, 6mM de MgCl₂ y 2,5U de taq polimerasa (15).

Las muestras fueron sometidas al siguiente programa: un paso de desnaturalización inicial a 95ºC por 9 min, la amplificación consistió en 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC, hibridización a 62ºC y extensión 72ºC por 30 seg cada una, finalmente un paso de extensión a 72ºC por 7 min (15).

3.- Separación electroforética en Geles de Agarosa.

Los productos obtenidos luego de la amplificación fueron visualizados mediante separación electroforética en gel de Agarosa al 2%, en buffer TAE (40 mM Tris-acetato pH 8.3, 1 mM EDTA), conteniendo bromuro de etidio (0,5μg/ml).  Las muestras se mezclaron con buffer de carga (0.005% azul de bromofenol, 50% glicerol) en una proporción de 2µl de buffer para 8µl de muestra, y se colocaron en cada uno de los bolsillos del gel. Para cada corrida electroforética se incluyó un patrón de peso molecular de 100bp (10µl de una solución de 2,1µg/ml).  Los geles de un tamaño de 15,5cm x 10,2cm y un grosor de aproximadamente 0,8cm, se corrieron en una cámara electroforética, sumergidos en buffer TAE, a 100V y 200mA durante una hora. Los fragmentos producto de la amplificación fueron visualizados bajo luz ultravioleta y registrados mediante fotografía digital (15). El registro de los resultados se realizó con una cámara digital Kodak DC290 que permite la captura digital de quimioluminiscencia. Las imágenes obtenidas se transfirieron a una computadora para su almacenamiento, impresión y análisis.