En un estudio realizado en nuestro laboratorio, se observaron anormalidades en la señalización post-membrana en los fibroblastos de la sinovial reumatoidea en comparación con la sinovial de pacientes Osteoarthritis(OA).(19) Así los fibroblastos reumatoideos mostraron una mayor proliferación, tanto en cultivos no estimulados, como luego de activación con bFGF in vitro. Además, los fibroblastos reumatoideos mostraron una menor actividad de las MAPKs, ERK-1 y ERK-2, en respuesta a la estimulación in vitro con este factor de crecimiento.(19) Este parámetro de señalización se correlacionó negativamente con la proliferación celular, tanto en fibroblastos reumatoideos como en los provenientes de pacientes con OA.

Asimismo, los fibroblastos reumatoideos mostraron una mayor fosforilación basal en tirosina de varios subsratos y respondieron pobremente a la inhibición de las fosfatasa de tirosina, cuando se compararon con fibroblastos de OA. No se sabe si los eventos tempranos de señalización, que involucran pasos bioquímicos de fosforilación en tirosina, son relevantes en la sobreexpresión de RANKL, o si la falta de expresión de la fosfatasa (Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome Ten - PTEN), recientemente descrita por PAP y su equipo de tratajo(20), pudiera contribuir en la desregulación de la expresión de RANKL en AR.

Recientemente hemos comenzado el estudio de la expresión de RANKL en fibroblastos de pacientes con Artritis Reumatoidea (AR) y comparado con la expresión en pacientes con OA, una enfermedad articular de base no inmunológica. Además, estudiamos el efecto de la estimulación de los FLS con diversos compuestos como IL-1, bFGF, PMA y vitamina D, sobre la expresión del RANKL en fibroblastos obtenidos de pacientes con AR y OA.

Obtuvimos muestras de membrana sinovial durante la intervención quirúrgica de tres pacientes con diagnóstico de AR y de tres pacientes con OA. Los estudios fueron realizados en los fibroblastos obtenidos entre el tercero y el sexto pasaje. Primero, comparamos la expresión basal de RANKL en fibroblastos de pacientes con AR y OA, y luego de cultivar en presencia de medio durante 48 horas. Como se observa en la Figura 1a, tanto los fibroblastos de la sinovial de pacientes con AR como los fibroblastos de la sinovial de pacientes con OA, expresaron la molécula RANKL. Sin embargo, esta expresión fue mayor en los fibroblastos reumatoideos, a nivel basal como luego de cultivar durante 48 horas en medio.

A los fines de examinar el papel potencial de factores de crecimiento y otros estímulos de conocida relevancia en la respuesta de fibroblastos, las células fueron cultivadas en presencia o ausencia de bFGF (100 ng/ml), PMA (10 ng/ml), IL-1 (2 ng/ml) o vitamina D (15nM). El día antes del ensayo las células fueron deprivadas de suero bovino fetal durante 12 horas, a fin de sincronizarlas en el ciclo celular.

Después de la incubación con los estímulos correspondientes, los fibroblastos fueron lisados en un buffer que contenía 100mM TRIS acetato, y Triton-X-IDO al 0.1%. 50 mg de proteínas del lisado fueron corridas, en un gel de electroforesis de SDS-poliacrilamida al 12% y fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Luego las membranas fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-RANKL humano. Después de tres lavados fueron incubadas con IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa. Las bandas fueron examinadas por densitometría usando un densitómetro de imagen.(19)

Como puede observarse en la Figura 1b todos los estímulos utilizados, produjeron una inhibición en la expresión del RANKL, tanto en los FLS reumatoideos, como en los fibroblastos de la sinovial de pacientes con OA, siendo el efecto más marcado con PMA y con vitamina D. Este efecto contrasta con lo observado en osteoblastos, células en las cuales estos estímulos inducen la expresión de RANKL. Pareciera que estos compuestos, necesarios para la expresión del RAKNL en los osteoblastos, no lo son para la expresión del RANKL en los fibroblastos.

Este es el primer reporte en el que se estudia el efecto de diferentes estímulos relevantes sobre la expresión del RANKL en fibroblastos, a fin de determinar cuales factores estimulan la expresión del RANKL en fibroblastos de la sinovial reumatoide y promueven osteoclastogénesis, así como el desarrollo de erosiones en los pacientes con AR.