Las especies Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae fueron seleccionadas en este estudio por su importancia clí­nica en humanos, a fin de diferenciarlas en cultivo lí­quido por espectroscopia por Resonancia Magnética Nuclear protónica (⁺HNMR).

Las cepas fueron aisladas de pacientes con diferentes cuadros clí­nicos infecciosos (Tabla I), a fin de considerar cualquier diversidad fenotí­pica que pudiera manifestarse en los cultivos bacterianos debido a la procedencia de la muestra, ya que se ha demostrado que cepas de una misma especie, provenientes de diferentes fuentes clí­nicas, pueden manifestar diversidad molecular en los cultivos ^(29,30). La presencia de estas moléculas en los cultivos, pudiera generar intensidades espectrales detectables por RMN y su ausencia, introducir cambios en el patrón de los espectros para una misma especie.

Todos los espectros ⁺HRMN obtenidos presentaron señales en la región de 0 a 10,0 ppm, región donde aparecen la mayorí­a de las señales de los protones encontrados en las moléculas orgánicas y biológicas ⁽³¹⁾. A fin de diferenciar las especies bacterianas, de su medio de cultivo, se seleccionaron en primer lugar, aquellas señales que se encuentran en los espectros de las bacterias y no en el espectro del medio de cultivo (CICC). El mayor número y de mayor intensidad se encuentra en la región alifática (0 a 4,2 ppm), (Fig. 1 y 2), donde es posible separar a S. agalactiae de las otras dos especies por el desplazamiento quí­mico de tres señales (1,04; 3,92 y 4,0 ppm). De manera similar, podrí­a diferenciarse S. aureus de las otras dos especies con las señales de 0,97; 3,91 y 3,98 ppm. Así­ mismo, K. pneumoniae puede diferenciarse de S. agalactiae y S. aureus mediante las señales 1,05; 3,51 y 3,53 ppm.

Se ha sugerido que las diferencias en las intensidades relativas de las señales en los espectros de las bacterias podrí­an relacionarse con el pool de metabolitos contenidos en el medio en que se cultivan ⁽³²⁾. En tal sentido, hemos considerado de interés, algunas señales que tienen notables diferencias en sus intensidades relativas, aunque presentan el mismo desplazamiento quí­mico (Figura 4).

Como todas las bacterias fueron cultivadas en caldo infusión cerebro corazón y en las mismas condiciones de cultivo, estas señales podrí­an ser de utilidad en la diferenciación de estas especies.

Esta situación fue considerada cuando se presentó solamente en dos especies bacterianas y no en las tres, así­ tenemos que en los espectros de S. agalactiae y S. aureus aparecen seis señales (1,01; 1,06; 3,50, 3,52, 3,94 y 3,96 ppm) con esta caracterí­stica, donde la intensidad de las primeras cuatro señales es mayor en el espectro de S. aureus que en el espectro de S. agalactiae, en las dos últimas ocurre lo contrario. Esta misma situación ocurre con los espectros de S. aureus y de K. pneumoniae, se comparten dos señales (1,03 y 2,27 ppm) donde es muy pronunciada la diferencia en la intensidad relativa K. pneumoniae. Igualmente ocurre con S. agalactiae y K. pneumoniae, comparten tres señales (0,98; 1,00 y 3,08 ppm), donde es muy marcada la diferencia en intensidad de la segunda señal (Fig. 4). .No fue objetivo del presente estudio identificar los metabolitos que permitieron diferenciar S. agalactiae, S. aureus y K. pneumoniae entre si y de su medio de cultivo. Esta investigación serí­a motivo de otro trabajo.

Existen reportes de identificación bacteriana mediante espectroscopia ⁺HRMN de algunas bacterias resuspendidas en buffer a partir de colonias desarrolladas en medios de cultivos sólidos ^(31,32). Este trabajo fue conducido mediante el análisis por espectroscopia ⁺HRMN directamente de los cultivos bacterianos en medios lí­quidos, donde no solamente se encuentran las moléculas estructurales de las bacterias per se, sino también, las moléculas extracelulares liberadas al medio de cultivo durante el crecimiento bacteriano, ya que algunas de ellas, probablemente generen intensidades que puedan ser registradas por ⁺HRMN. Por otra parte, el registro de señales especí­ficas para cada grupo bacteriano en los cultivos lí­quidos persigue el abordaje de la espectroscopia por Resonancia Magnética Nuclear (SRMN) en la identificación bacteriana de rutina y de esta forma disminuir el tiempo y/o costos de procesamiento de muestras clí­nicas por métodos convencionales. Este es el primer reporte conocido de identificación bacteriana en cultivo por SRMN

Sin embargo, se requieren estudios posteriores con un número significativo de diferentes muestras clí­nicas de origen infeccioso, para establecer aquellas señales que por su reproducibilidad puedan ser caracterizadas a fin de crear una base de datos que permitan la identificación de la etiologí­a bacteriana en algunas muestras biológicas.

Agradecimientos

-Al Consejo de Desarrollo Cientí­fico y Humaní­stico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela por el financiamiento de este proyecto identificado con el Nº PI 09-00-6468-2006

-Profesor Luciano Vargas por su constante apoyo en los términos relacionados con la fí­sica cuántica.