Material vegetal

El material vegetal (hojas frescas) fueron obtenidas o recolectadas de tierras destinadas a la agricultura de yucas ubicadas en el sector “Fundo Coropo” del municipio “Francisco Linares Alcántara”, estado Aragua.

Extracción

Para la obtención del extracto acuoso se procedió a pesar 5 g de material vegetal, colocándolos en un vaso precipitado de 400 mL con 200 mL de agua destilada a 100 °C durante 8 minutos, dejándolo en reposo por 24 horas. Por último, se procedió a filtrado empleando papel de filtro Whatman número 4 (7).

Para el extracto metanólico se pesaron 5 gramos de muestras, colocándolas en un vaso precipitado de 400 mL con 200 mL de metanol al 70 % (v/v). La muestra se dejó macerando durante 24 horas con agitación a 150 rpm a una temperatura de 25 °C. El filtrado se realizó a través de papel de filtro Whatman número 4 y el exceso del solvente utilizado se evaporó a presión reducida utilizando un rota evaporadora (7).

Cuantificación de compuestos fenólicos totales (polifenoles)

La determinación de fenoles se realizó por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu. A 50 µL de muestra fueron adicionados a 125 µL del reactivo de Folin, y 400 µL de carbonato de Sodio 7,1 % (p/v), completándose con agua destilada hasta 1000 µL. Seguidamente se prepararon 5 patrones de concentración de 50, 100,150, 200 y 250 µg/mL, a partir de una solución patrón madre de Ácido Gálico (fenol) de concentración 500 µg/mL. Por último, realizó la lectura a 760 nm empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (Thermo Scintific), y expresando los resultados como equivalente a ácido gálico (EAG)/g material vegetal (MV) (9).

Determinación de flavonoides

La determinación de flavonoides se realizó siguiendo el siguiente protocolo: 100 µL de muestra fueron mezclados con 30 µL de NaNO₂ al 5 % (p/v), 30 µL de AlCl₃ 10 % (p/v), 200 µL de NaOH a 1M y ajustados con agua destilada hasta un volumen final de 1000 µL, se realizó la lectura espectrofotométrica a 510 nm y se comparó con la curva patrón usando como estándar (+)-catequina. Los resultados fueron expresados como mg de Catequina Equivalente (CE) / g de material vegetal (MV) (10).

Método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)

Para evaluar la actividad antioxidante se usó el método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma Aldrich Co®) con una solución 100 µM de DPPH en metanol al 80 %, la cual permite observar una disminución de la absorbancia, debido a la cesión de un átomo de hidrógeno por parte de los compuestos antioxidantes presentes en los extractos. En una cubeta de vidrio se colocaron 100 µL de extracto y 2,9 mL de DPPH. La ab­sorbancia se monitoreó cada 5 minutos por 30 minutos a una longitud de onda de 515 nm. La absorbancia de referencia (A₀) fue ob­tenida al sustituir el volumen de extracto por metanol al 80 %. El porcentaje de reducción de DPPH se obtuvo de la expre­sión: DPPH (%)= (A₀-A_n) 100 / A₀, donde A₀ y A_n fueron las absorbancias de referencia y de la muestra, respectivamente (11).

Determinación de la capacidad antioxidante por el ensayo del poder reductor férrico (FRAP)

Este ensayo permite determinar la capacidad reductora de los extractos. Para esto 100 μL de cada extracto se mezcló con 3 mL de reactivo FRAP (300 mM de tampón de acetato de sodio y ácido acético, solución de diamonio-2, 4,6-tri (2-piridil)-s-triazina) de 10 mM y solución FeCl₃ 20 mM), en una relación de volumen de 10: 1: 1.Se dejó reposar a temperatura ambiente durante 4 minutos, para luego leer las absorbancias a 593 nm, empleando un espectrofotómetro UV/VIS Génesis 20 (Thermo Scintific).Se empleó FeSO₄como estándar y los resultados se expresaron en µmol Fe⁺²/ g MV (12).

Análisis estadístico.

Todas las determinaciones se realizaron por quintuplicados y se expresaron los valores como los promedios ± desviación estándar (DE). Para la comparación de la concentración tanto de fenoles totales, flavonoides y actividad antioxidante se aplicó un análisis de varianza de dos vías con interacción (ANOVA), usando el programa Statistix 9.0 para Windows.