Se presentó un estudio de enfoque cuantitativo, de diseño observacional,
no experimental, de tipo clínico, analítico de corte transversal. Se realizó la
recolección de muestras de sangre de manera aleatoria a donantes que acudieron
al servicio de Banco de sangre del Hospital “Lcdo. José María Benítez” desde
octubre de 2023 hasta febrero de 2024.
La
población de estudio estuvo constituida por 37 donantes que acudieron de forma
voluntaria al servicio de Banco de
sangre del Hospital “Dr. José María Benítez”, los cuales cumplieron con los
criterios establecidos por el banco de sangre para poder ser donantes: mayor de
18 años y menores de 61 años, peso mayor a 50 kg, haber dormido la noche
anterior al menos 8 horas, no haberse realizado tatuajes en los últimos 6 meses,
no presentar alguna patología infectocontagiosa en menos de 6 meses y que
fueron operadas en un periodo menor de un año.
En cuanto a las variables de
estudio se registró las condiciones socio demográficas: sexo, edad,
procedencia, estrato socioeconómico por método de Graffar y ocupación, se
identificaron los factores de riesgos por el uso habitual de plástico: si es
vegetariano, consumo habitual de pescados y mariscos, uso de envoltura plástica
para conservar comida, consumo habitual de agua en botellas plásticas, uso de
microonda para calentar comida. Los
datos se obtuvieron a través de un instrumento tipo encuesta con preguntas
directas.
Las muestras se recolectaron
a través de punción venosa que se realizó mediante una aguja de acero
inoxidable 21G estéril de grado quirúrgico y que se conectó al tubo de ensayo
de vidrio al vacío con anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de
acuerdo a los protocolos de la Declaración de Helsinki, de modo que se extrajo
5 mL de la sangre de la vena del donante directamente al vacutainer de vidrio y se mezcló la solución anticoagulante del
tubo con la sangre obtenida para su preservación y manipulación (8).
Asimismo, el manejo y
transporte de las muestras, se tomó cada tubo de ensayo e identificó el número
de paciente para posteriormente ubicarlo en una cava previamente esterilizada
con etanol al 70 %. Esta cava con una rejilla para tubos de ensayo donde se
ubicó cada muestra. Para el control de la temperatura se ubicó en la cava
hermética y para evitar las vibraciones se colocó esta misma cava en una caja
cubierta de espuma de poliuretano para ser transportada.
Para una garantía y control
de calidad se adoptó un protocolo sin plástico, destinado a evitar la
contaminación por microplásticos, durante la recolección, el almacenamiento, el
procesamiento y el análisis de las muestras. Además, la digestión de las
muestras de sangre, la filtración y los pasos de análisis de espectroscopía se
llevaron a cabo en una sala dedicada. Todas las herramientas de plástico fueron
sustituidas por herramientas de vidrio esterilizado. Se usó batas de
laboratorio de algodón y guantes de látex de un solo uso durante todas las
fases del experimento.
También se utilizó etanol (70
%) para limpiar las superficies de trabajo antes de iniciar todos los
procedimientos y durante el tiempo experimental. La cristalería y los
instrumentos, como tijeras y pinzas, se lavaron con líquido lavavajillas, se
enjuagaron tres veces con etanol al 70 % y luego se enjuagaron con agua
desionizada filtrada. Todos los líquidos, incluido el etanol al 70 % y el agua
desionizada, se filtraron a través de membranas filtrantes con un tamaño de
poro de 20 µm.
Tratamiento de extracción. Las
muestras de sangre se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 minutos para separar
el plasma de los componentes celulares. Posteriormente, se separó el
sobrenadante quedando solo el paquete globular, al cual se le adicionó de una
solución lisante constituida por tritón y dimetilsulfoxido al 2 %, para luego
volver a centrifugar por 5 min a 3 500 rpm. Se retiró el sobrenadante para
luego añadir 5 mL de tampón TRIS-HCl (400 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,5 % SDS,
Trizbase, HCl H1758), los viales se calentaron en un baño de agua a 50 °C
durante 1 h para desnaturalizar las proteínas. Para digerir las proteínas
presentes en la sangre completa, se añadieron100 µL de la proteinasa K (1 mg/mL, junto con 1 mL deCaCl25
mM) y los viales se incubaron durante 1 h a 60 °C. El CaCl2 evita la autolisis
de la proteinasa K y mejora la estabilidad térmica y la unión al sustrato. Finalmente, los
viales se agitaron en una mesa de agitación durante 20 min a temperatura
ambiente y se calentaron una vez más a 60 °C durante 20 min. Este procedimiento
permitió la separación de cualquier proteína o constituyente celular de los
posibles polímeros presentes, los cuales por diferencia de densidades y
estructura sin degradar por el tritón y DMSO, quedan en el sobrenadante. Es de
destacar que se aplicó este método a las muestras luego de un análisis con
muestras externas empleadas como control y aplicación de las técnicas para la
identificación de los polímeros. Dicho protocolo fue evaluado, establecido y
realizado en el Laboratorio de metales en la Universidad de Carabobo, sede
Aragua (Aragua, Venezuela).
Caracterizacion de los
microplásticos
Como técnica de análisis para determinar los diferentes tipos de
polímeros existentes en las muestras se empleó la de espectroscopía de
infrarrojo con transformación de Fourier (FTIR).
La utilidad de la
espectroscopia infrarroja surge porque las diferentes estructuras químicas
(moléculas) producen diferentes huellas espectrales. Mediante
este método se puede llegar a identificar microplásticos en un rango de 50–500 μm en un periodo de
tiempo muy corto, además de poseer una alta resolución espacial (10 - 20 μm);
sin embargo, puede presentar inconvenientes al momento de preparar las muestras
(9). Para el análisis de identificación
de los polímeros presentes en las muestras se procedió a colocar en la sonda
óptica tubular 300 µL de muestra previamente diluida en un búfer empleado el
equipo Lyza 7000 el cual trabaja en un rango
espectral de 8100–350 cm−1.
Análisis estadístico
Finalmente, se utilizó
análisis estadístico descriptivo para variables cualitativas frecuencia
absolutas y porcentajes y para variables cuantitativas se registró media
desviación estándar y para resumir los datos y comparar los resultados entre
las muestras se utilizó chi cuadrado todo procesado en una base de datos en
Excel 2013 y paquete estadístico EPIINFO 7,2-5,0 y SPSS Versión 15 con un
intervalo de confianza de 95 % y una significancia de p <0,l05.
Consideraciones bioéticas
Todos
los procedimientos fueron ejecutados de
acuerdo a los protocolos de la Declaración de Helsinki. Asimismo, se contó con
la aprobación del directivo de la institución Hospital “Lcdo. José María
Benítez”.
