Los
experimentos se
llevaron
a
cabo
en
15
ratas
macho
adultas,
Sprague
Dawley
(350-400g),
con
alimentación
ad
libitum, mantenidas
bajo
un
esquema
de
luz/oscuridad
de
12:12
horas
y
tratadas
de
acuerdo
a
los
lineamientos
del
National
Institute
of
Health
(NIH, 1996). Se constituyeron
3
grupos
experimentales
de
5
ratas
cada
uno,
identificados
como:
control, inflamación
(A)
e
inflamación
pretratado
con
indometacina
(B).
Inflamación
Los animales fueron anestesiados
con
tiopental
sódico
(60mg.kg-1,
intraperitonealmente),
luego
se
administró
0,05mg
de
atropina
diluidos
en
0,5ml
de
solución
fisiológica,
por
vía
subcutánea
para
reducir
las
secreciones
respiratorias.
La
temperatura
se
mantuvo
constante
(37,5±0,5ºC;
media±DE)
gracias
a
una
manta
eléctrica
colocada
en
la
superficie
ventral
del
animal,
regulada
mediante
retroalimentación.
A los animales
del grupo A se les introdujo la pata trasera
izquierda en agua a 60ºC/60
segundos para inducir
una inflamación periférica
local (18); 15 horas después,
se realizó una laminectomía de los segmentos
T11-L3 para exponer
el engrosamiento lumbar,
bajo las mismas condiciones de anestesia descritas
previamente. Al grupo B, una vez anestesiado
el animal, se administró indometacina
(4mg.k-1, por vía intraperitoneal) (19), pasados 30 minutos, se procedió a tratar el animal de la misma manera que al grupo A. Los animales del grupo control se sometieron a la misma manipulación pero sumergiendo la pata en agua a temperatura ambiente (26°C).
Posterior a la laminectomía, el engrosamiento lumbar de la médula fue resecado y crioprotegido a -4ºC en solución buffer Tris HCl, pH 8.0 (Tris base 50mM; EDTA 10mM; Triton X-100 1%; NaF 50mM) y se administró 0,1cc de succinilcolina intracardíaco, para sacrificar al animal.
Muestras ipsi y contralaterales de cada ADM (1mm3) fueron obtenidas mediante punches de 1mm de diámetro, a partir de cortes transversales medulares colocados en una lámina de aluminio sobre una cama de hielo seco. Los fragmentos tisulares fueron almacenados por separado en viales de acuerdo al grupo respectivo, y homogeneizados en solución buffer Tris HCl, pH 8,0 (1mg.mL-1). La concentración de proteínas totales en los homogeneizados se determinó mediante lectura espectofotométrica a 595 nm.
Electroforesis
Los homogenatos
de
ADM
y
un
marcador
de
PM
comercial
de
rango
variable
(Blue
Rangers,
Promega)
se
migraron
electroforéticamente
en
geles
de
poliacrilamida
al
10%
(p/v),
en
condiciones
reductoras,
en
una
cámara
vertical;
se
cargaron
20µg
de
proteínas
totales/pozo
de
cada
una
de
las
muestras,
previamente
tratadas
con Tris-HCl 0,5 M; pH 6,8; dodecilsulfato de sodio (SDS) al 20%; glicerol bidestilado 1mL; azul de bromofenol 10mg; 2-βmercaptoetanol 500µL y calentadas a 70ºC por 10 minutos. La
migración
se
hizo
en
una
mini-cámara
(Bio-Rad
modelo1000/500)
a
corriente
constante
de
200V
por
45
minutos
a
4˚C
en
buffer
Tris-glicina
pH
8,3
(Tris
20
mM;
glicina
192
mM,
SDS
al
1%
v/v).
Las
proteínas
totales
fueron
reveladas
en
los
geles
mediante
la
tinción
con
Coomassie
blue
combinado
(20).
Expresión
de
Anti Nav1.3 mediante Western Blot
Las
proteínas
migradas,
se
electrotransfirieron
a
papel
de
nitrocelulosa
(0,45
µm,
Pierce)
a
100V
por
1h.
Luego,
se
incubaron
por
1
hora
con
el
anticuerpo
anti Nav1.3 (11), dirigido a un péptido purificado
(aminoácidos 511-524) de la subunidad α del Nav1.3 de rata (Chemicon International), diluido 1:200 con agua destilada. Se empleó un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa,
diluido
1:20000
en
solución
de
bloqueo
buffer
TBS-Tween
(Tris-HCL
20mM,
NaCl
150mM,
Tween
20
0,05%
v/v)
y
posterior
revelado
por
luminografía.
El
revelado
de
los
inmunocomplejos
se
hizo
empleando
luminol
y
peróxido
de
hidrógeno
diluído
1:1
(Supersignal, Pierce, USA). Con la quimioluminiscencia
se
impresionó
una
película
de
rayos
X
(Pierce, USA),
seguido
de
revelado
fotográfico
(21).
Análisis cuantitativo de las imágenes
Los geles de electroforesis fueron digitalizados y sus bandas medidas mediante perfiles densitométricos a través del software de procesamiento digital de imágenes Image Tool®. Los valores de densidades relativas obtenidos en las bandas correspondientes al ADM contralateral se sustrajeron de los correspondientes al ADM ipsilateral (D-I), posteriormente se graficaron y se trataron mediante promediación móvil de 10 términos estableciéndose los intervalos de confianza con los percentiles 5 y 95. Con el mismo software, se calculó el área bajo la curva para determinar las diferencias relativas (%) en la expresión de proteínas totales de las ADM ipsi y contralaterales a la inflamación periférica de todos los grupos experimentales.
