Parasitología
Hallazgos de Amibas de Vida Libre de los géneros Acanthamoeba y Naegleria. Una experiencia venezolana.
Pacientes y métodos
En 530 personas, con diversos síntomas, fue investigada la presencia de AVL, mediante el análisis de diversas muestras, incluyendo lentes de contacto o líquido de lavado para el cuidado de dichos lentes. Entre estas 530 personas, 273 presentaban síntomas oftalmológicos, 30 síntomas neurológicos, 79 eran usuarios de lentes de contacto, 61 pacientes tenían rinitis, 30 diarrea, 3 otitis y 54 eran personas asintomáticas. De los 273 pacientes con síntomas oftalmológicos, 236 tenían UC unilateral y dos de ellos presentaban úlcera bilateral, por lo cual se examinaron un total de 238 muestras de este tipo de lesión. Además, se examinó muestras a 2 pacientes con queratitis y a 31 pacientes con conjuntivitis crónica que no respondían a los tratamientos usuales. También fueron analizadas 2 corneas recién extraídas, que fueron remitidas al laboratorio, posterior a un procedimiento quirúrgico. De los 30 pacientes con síntomas neurológicos, se examinó el LCR a 28 ellos y material de biopsia cerebral en 2 pacientes.
A 79 usuarios de lentes de contacto, se le estudiaron sus lentes y/o los líquidos de lavado, 49 presentaban síntomas que iban desde prurito y ardor hasta UC y 30 eran asintomáticos.
En resumen, se examinaron muestras de LCR, muestras de úlcera corneal, cornea, hisopado conjuntival, líquido de lavado de lentes de contacto, lentes de contacto, biopsia cerebral, hisopados nasales, heces y secreción ótica.
Todos los aspectos relacionados con esta investigación se realizaron ajustados a las normas y procedimientos bioéticos que rigen la investigación en humanos, garantizando la confidencialidad en el manejo de los datos personales de los individuos. Asegurando la comprensión del procedimiento a seguir y el riesgo-beneficio, para obtener su consentimiento.
Muestras: toma, transporte y procesamiento. Las muestras fueron tomadas en los servicios médicos especializados, dependiendo de la sintomatología del paciente y algunas en el Laboratorio de Amibiasis, como los hisopados nasales y de fondo de saco del ojo, lentes y solución de lavado. Una vez tomadas, fueron trasladadas, en cámara húmeda y medios de transporte al Laboratorio de Amibiasis, para la investigación parasitológica y a los laboratorios de Micología y Bacteriología.
El procesamiento de las muestras, se realizó en general, mediante examen microscópico directo (entre lámina y laminilla), añadiendo una gota de medio líquido, de Page modificado por Chinchilla y cols. (1979) (14), que llamaremos medio de Chinchilla líquido, si la muestra lo ameritaba. Cultivo en placas con medio de sólido, (al medio líquido le añadimos la cantidad de agar, recomendada por Chinchilla y cols.). A dicha placa, una vez colocada la muestra, se le añadía 0,5 ml de suspensión de Escherichia coli, vivas o muertas, ajustada a 27% de turbidez, 36% de transmitancia y 0,56-0,45 de absorbancia (concentración ajustada al patrón Mac Farland). El cultivo se completaba hasta 8-10 ml, con medio de cultivo de Chinchilla líquido, transformándose en un cultivo bifásico. Se incubaron, los cultivos, hasta por 8 días, a 37ºC y 42ºC, realizando observaciones diarias, con microscopio invertido. En el lugar de la toma de la muestra se realizaron controles de ambiente, con placas de medio de Chinchilla las cuales fueron abiertas y mantenidas mientras se tomaba la muestra y se procesaron en idéntica forma que las que contenían las muestras.
Muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR). El LCR fue tomado por el médico, bajo condiciones de esterilidad, trasladado al laboratorio a temperatura ambiente y con medidas de bioseguridad. Se procesó inmediatamente y el remanente, se conservó a temperatura ambiente, hasta culminar todos los estudios. Se realizó un examen microscópico del LCR, antes y después de centrifugar a 400 g, 5 minutos para buscar trofozoítos móviles. A partir del sedimento, se realizó un examen directo y 2 frotis para coloración con Giemsa y Hematoxilina Eosina. Se sembró 1 ml del LCR en medio de cultivo de Page. Se realizó la prueba de flagelación, del líquido recién tomado y posteriormente del cultivo positivo para AVL.
Prueba de flagelación: Se colocaron 2-3 gotas del líquido en un tubo de ensayo, con 2-3 ml de agua destilada estéril, se incubó a 37 ºC y 42 ºC hasta por 8 días. La evaluación microscópica se hizo tomando alícuotas, para observar entre lámina y laminilla.
A partir de los cultivos positivos, la prueba se realizó de dos maneras:
a) El material que se recogió de la placa con crecimiento fue colocado en una placa de Petri vacía y estéril, se le añadió 10 ml de agua destilada estéril. Se incubó a 37 ºC y 42 ºC, observando al microscopio invertido, cada media hora o hasta observar los flagelados. También se examinó microscópicamente entre lámina y laminilla.
b) En la placa de cultivo donde se observó trofozoítos ameboides, se le retiró el medio líquido, sin desprender las amibas y se añadió 10 ml de agua destilada estéril y se continuó en igual forma que en el procedimiento anterior.
Muestras oftalmológicas incluyendo muestras de úlcera corneal (UC)
Estas muestras fueron tomadas por un oftalmólogo, previa anestesia tópica con clorhidrato de proparacaina al 0,5%, utilizando el microscopio de la lámpara de hendidura, para identificar los bordes de la lesión, de los cuales se tomaron varias muestras utilizando un bisturí Nº 15, raspando la lesión, y se procesaron de la siguiente manera: Un primer raspado, se colocó entre lámina y laminilla con una gota de medio líquido y se transportó en cámara húmeda al Laboratorio, donde se realizó el examen microscópico directo. El segundo raspado se colocó en un frasco estéril con tapa de goma con 2,5 ml de medio líquido de Chinchilla estéril, para transportarlo al laboratorio. Al llegar al Laboratorio se colocó el contenido del segundo frasco en dos placas de medio de Chinchilla sólido, se añadió la suspensión bacteriana y hasta 8 ml de medio líquido de Chinchilla y se incubó a 37ºC. También se tomaron muestras por triplicado con hisopo estéril, para investigación micológica y bacteriológica, para lo cual se sembraron en medio de Saboureaud y Caldo Todd y fueron procesadas en los laboratorios de Microbiología y Micología.
Cornea recién extraída
Esta muestra fue tomada por un oftalmólogo y enviada al laboratorio. Una vez allí, la muestra se fragmentó a fin de sembrar varias placas y aumentar las posibilidades del hallazgo de Acanthamoeba. Cada fragmento se cultivó y se procedió igual que para la muestra de UC.
Hisopado conjuntival
Se tomaron muestras del fondo de saco conjuntival con hisopos estériles, se realizó examen microscópico directo y cultivo en los medios de Chinchilla líquido, Saboureaud y Caldo Todd. Los hisopos con la muestra se colocaron en frascos con 2,5 ml de medio líquido de Chinchilla y se procedió igual que para la muestra de UC. El material conjuntival recogido con uno de los hisopos se colocó en una lámina, para observación microscópica entre lámina y laminilla.
Lentes de contacto y líquidos usados para su cuidado
Se examinaron los lentes al microscopio invertido, colocándolos en una placa de Petri estéril. Posteriormente se pasaron a una placa con medio de Chinchilla sólido y se añadió 1 ml de medio líquido de Chinchilla, suficiente para cubrirlos y se incubaron a 37ºC por un máximo de 10 minutos, al cabo de los cuales, se retiraron los lentes y se colocaron en Caldo Todd, por 10 minutos. A la placa donde estuvieron los lentes, se le añadió medio de cultivo de Chinchilla líquido y suspensión bacteriana y se procesaron como se explicó para las muestras anteriores.
Solución usada para el cuidado de los lentes
Se tomaron muestras tanto de la solución usada, contenida en el estuche donde se guardaban los lentes, como la no usada de los frascos que llevó el paciente. Cada solución se procesó tal y como se describió anteriormente, para la investigación de AVL, hongos y bacterias.
Búsqueda de portadores asintomáticos
Se seleccionaron personas sin ningún tipo de sintomatología, que accedieron voluntariamente a participar en el estudio. Se tomaron hisopados de cada fosa nasal y se realizó exudado faríngeo, estas muestras fueron procesadas tal como se describió anteriormente para las muestras tomadas con hisopos, tanto para la investigación de AVL, como para la de hongos y bacterias.
En este estudio descriptivo, los datos fueron expresados a manera de porcentajes. La prueba de chi cuadrado se usó para comparar las variables. Las diferencias presentadas con una p≤ a 0,05 fueron consideradas estadísticamente significativas. |