El hallazgo de Acanthamoeba o Naegleria en 32 casos de 530 estudiados, representa el 6,04%. Estos resultados corroboran las observaciones de diversos autores, quienes consideraron que tomando en cuenta las posibilidades de contacto que tiene el hombre con estas amibas, son pocos los casos de enfermedad producidas por ellas y las comparan con otras protozoosis de mayor impacto, tales como tripanosomiasis, toxoplasmosis y malaria, lo cual podrí­a aparentemente les resta importancia, pero la gravedad de las enfermedades que producen, elevada mortalidad y su distribución cosmopolita, justifican su búsqueda. ^(2,4,7,15) 

La metodologí­a empleada para la investigación de AVL en pacientes con afecciones neurológicas, nos permitió encontrar Naegleria fowleri en 2 casos, por examen directo y cultivo del LCR y Acanthamoeba sp en el material de una biopsia cerebral, realizada a un paciente con un adenocarcinoma metastático. En los tres casos el diagnostico se realizó después de varios dí­as de evolución de la enfermedad, a pesar de que en los casos de Naegleria, existí­an antecedentes epidemiológicos que podrí­an haber orientado el diagnóstico temprano. Lamentablemente el pronóstico es grave, debido a lo extenso de las lesiones ⁽⁴⁾. En los dos casos positivos a Naegleria, los antecedentes epidemiológicos coinciden con los reportados por Visvesvara y cols., quienes señalan que deberí­a haber contacto prolongado y/o forzado del agua hacia la mucosa nasal ⁽⁴⁾. En el primer caso, el paciente que se lavó la nariz con una manguera que se encontraba expuesta al sol, en horas de mediodí­a y que estaba conectada a un tanque de agua, probablemente, las amibas estaban en el agua residual de la manguera que fueron impulsadas a presión hacia la nariz del paciente, así­ como en el segundo caso se trató de una escolar que nadó en un pozo de un rí­o, donde pasó mucho tiempo en el agua con cierta temperatura en horas de mediodí­a. El hecho de que solamente Naegleria fowleri, ha sido encontrada como patógena en humanos, nos permitió afirmar, que en ambos casos nos encontrábamos en presencia de dicha especie. Esto fue confirmado posteriormente mediante PCR.

La metodologí­a empleada, permitió el hallazgo de Acanthamoeba sp en 14 casos de afecciones de córnea: 13 de UC y 1 de queratitis. Llama la atención que en todos los trabajos revisados, refieren que la afección corneal ocasionada por Acanthamoeba sp eran catalogadas como queratitis. En este trabajo el mayor hallazgo de Acanthamoeba sp fue en pacientes con UC y solamente se diagnosticó en 1 caso con queratitis.

En el mundo, se han reportado, aproximadamente 3.000 casos de afecciones corneales, desde 1.980 hasta aproximadamente el año 2.000 ⁽⁴⁾. Sin embargo Morlet y col. obtuvieron que el 13% de las queratitis investigadas ⁽¹⁶⁾, son causadas por Acanthamoeba sp, siendo la mayorí­a de los pacientes usuarios de lentes de contacto, mientras que en la mayorí­a de los casos aquí­ identificados con queratitis y úlceras corneales, no lo eran. Podemos considerar que el uso de lentes de contacto, es un factor que se puede relacionar con la aparición de UC, ya que de 79 usuarios de lentes examinados (13,9%) tení­an esta afección, aunque no en todas las lesiones el agente causal fue Acanthamoeba sp. Además, llama la atención que de los 14 hallazgos de Acanthamoeba sp en usuarios de lentes de contacto, 13 ocurrieron en pacientes con sí­ntomas y solo 1 en un usuario asintomático. Podrí­amos pensar que de alguna manera Acanthamoeba podrí­a intervenir en la presencia de esos sí­ntomas. La búsqueda de las amibas, en los lentes de contacto y las soluciones empleadas para su cuidado, ha sido recomendada por el "Center for Disease Control and Prevention"� (CDC) de Atlanta desde 1.986 y nuevamente, en el año 2007, señalan que el incremento del riesgo de keratitis por Acanthamoeba, es un problema de salud pública ⁽¹⁷⁾ y autores como Meisler y Rutherford y Mc Culley y cols, consideran dichos lentes como vehí­culo para que Acanthamoeba sp se introduzca en la cornea ante cualquier traumatismo ^(18,19). El hallazgo de Acanthamoeba sp en los lentes de contacto y /o las soluciones empleadas para su cuidado, es considerado por Walochnik y col. como "confirmatoria"� ante una UC de la cual no se aisló el protozoario ⁽¹⁰⁾, pero Froumis y cols. ⁽²⁰⁾, señalan que no necesariamente la amiba que sea aislada del lente, también lo será de la UC del usuario, y se demostró por biologí­a molecular que pueden encontrarse especies diferentes en el lente de contacto y en la úlcera. Esto concuerda con nuestros resultados, ya que en 5 casos, de pacientes con UC de origen no amibiano y en el caso del paciente que presentaba lo que llamamos sí­ntomas menores, se identificó una amiba de los lí­quidos usados para el cuidado de los lentes y/o en los lentes. Compartimos la opinión de Wilhemus en que tener una de estas amibas, en el lente y/o los lí­quidos usados para su cuidado, establece un riesgo para el usuario, por la repetida exposición del ojo a una amiba que tenga la posibilidad de producir daño a la córnea. ⁽⁸⁾  Además, se demostró que las amibas del género Acanthamoeba experimentalmente, pueden producir daño a la cornea sin requerir de lesión previa ⁽²¹⁾ entonces, en los 6 casos antes mencionados, en los cuales evidenciamos amibas de este género en los lentes y/o sus lí­quidos, la amiba podrí­a no ser patógena, o aún haberse dado todas las condiciones para la colonización de la cornea. Además, se requiere de ciertas condiciones, para la instalación de la amiba en el ojo, tales como largo tiempo en el uso de dichos lentes, baja higiene personal, limpieza inadecuada de los lentes, formación de una biopelí­cula en los lentes y se presentan una secuencia de eventos que tal vez no se habí­an dado en dichos usuarios, que van desde el contacto de la amiba con el ojo hasta la aparición de la lesión ⁽¹⁷⁾. Al respecto se ha establecido que la acción sobre cultivos de células epiteliales, depende de la presencia de un genotipo determinado de la amiba, en consecuencia, ameritarí­a realizar pruebas moleculares, para saber si la amiba encontrada pertenece a una especie patógena conocida y así­ conocer el riesgo para el usuario de lentes de contacto. ⁽⁸⁾  Se ha reportado frecuentemente el hallazgo de AVL en usuarios de lentes de contacto asintomáticos y que la presencia de microlesiones o el estado inmunológico del individuo, pueden ser determinantes en el curso de una infección, ya que se considera que la amiba puede penetrar por estas lesiones. Sin embargo, no debe menospreciarse el hallazgo de cualquier amiba del género Acanthamoeba en usuarios de lentes de contacto, debido no solamente al potencial patógeno del protozoario, sino a su capacidad de portar bacterias como Pseudomonas aeruginosa, reconocida como el principal patógeno ocular ⁽¹⁰⁾. De los pacientes con UC y usuarios de lentes de contacto, en 2 de ellos donde no se demostró Acanthamoeba sp, se aisló Pseudomonas aeruginosa de la lesión y se encontró la amiba en el lí­quido de lavado de los lentes, no habiéndose comprobado si esta amiba portaba la citada bacteria. En el examen microscópico de los lentes y lí­quido de conservación mantenido en el estuche, así­ como en el interrogatorio que se hizo al paciente, pudimos evidenciar que la limpieza era inadecuada, lo cual favorecí­a la acumulación de detritus que podrí­an servir de alimento a las amibas para su mantenimiento y reproducción y en consecuencia estos constituirí­an la fuente de infección, para la producción de lesiones oculares. Los usuarios no desinfectaban los lentes con la frecuencia debida, observación en la que coincidimos con Dini y col. ⁽²²⁾. En el examen de los lentes al microscopio invertido, se observó una pelí­cula, en la periferia del lente donde observamos detritus celulares y bacterias, la cual se ha señalado como necesaria para la transmisión de la amiba al ojo ^(17,23). 

Podrí­amos concluir que la producción de una UC, por Acanthamoeba sp, por observación en nuestros pacientes y por señalamientos de otros autores, previamente citados, esta relacionada con uno o varios de los siguientes factores: trauma corneal, exposición a aguas contaminadas y asociación al uso de lentes de contacto. Entre estos últimos, el uso indebido de los lentes al dormir o nadar, la limpieza inadecuada de los lentes y los estuches donde se guardan, así­ como el uso de solución salina para el lavado, (que usaban algunos de nuestros primeros pacientes). Consideramos que también podrí­a influir no desproteneizar el lente con la frecuencia requerida, ya que favorecerí­a la permanencia de la pelí­cula de detritus en el mismo. Sin embargo, en varios casos, los pacientes señalaron que sus sí­ntomas comenzaron al usar los lentes después de desproteneizarlos, a pesar de que no conseguimos amibas en estos casos. Los pacientes que presentaron UC por Acanthamoeba sp fueron tratados con clorhexidina-biguanida al 0,002% y/o polihexametileno-biguanida al 0,002% y consideramos que curaron. Sin embargo, serí­a interesante tratar de ubicarlos, para su control, ya que los nuevos reportes sobre la reactivación de posibles quistes ⁽²⁴⁾, llamados quistes "durmientes"�, que pudieran haber quedo en el estroma y resistido a las drogas, así­ lo aconsejan ^(3,4). Además, ninguno de los autores consultados, refieren un tratamiento como cien por ciento seguro. En 1994 reportamos el primer caso de curación en Latinoamérica. ⁽²⁵⁾

El hallazgo de Acanthamoeba sp en los primeros dos pacientes con conjuntivitis fue casual^{. (26)} En consecuencia se decidió buscar las amibas en otros casos de esta afección. Estos resultados alertan sobre la necesidad de aumentar su búsqueda, en estas afecciones agudas y crónicas. La casuí­stica demostró Acanthamoeba sp, en 2 casos con conjuntivitis aguda y en dos casos con conjuntivitis crónica.

En los 5 casos con diarrea, se observó Acanthamoeba sp en 3 de ellos. Al repetir las muestras a los pocos dí­as, no se volvió a encontrar las amibas. Este resultado difiere de los reportes de Moura y cols., quienes encontraron permanencia de Acanthamoeba sp hasta por dos meses. Estos autores presentaron la hipótesis del posible comportamiento de esos pacientes como portadores asintomáticos ⁽²⁷⁾. Llama la atención el hecho de que en el laboratorio de Amibiasis, en sus 36 años de fundado y la experiencia acumulada en el procesamiento de muestras de heces para la investigación de parasitosis intestinales, solo se haya evidenciado AVL en las heces en 5 casos. Si bien las muestras no se siembran de rutina en los medios indicados para el aislamiento de estas amibas, el hallazgo en el examen directo es una posibilidad, por lo cual suponemos que hay una frecuencia muy baja de personas que podrí­an ser consideradas portadoras.

En cuanto a la morfologí­a de las amibas encontradas, tanto en Acanthamoeba sp, como en Naegleria sp la morfologí­a y tamaño de los quistes, coincide con las caracterí­sticas descritas ^{(1, 3, 4,)}. En los de Acanthamoeba sp, se observó diferencias entre los quistes de un mismo aislado, tales como el número de poros y las puntas del endoquiste tal y como reportan Walochnik y cols ⁽¹⁰⁾. Diferimos de la opinión de Szenási y cols. ⁽²⁸⁾, quienes consideran que debe realizarse el diagnóstico diferencial con Acanthamoeba sp solo en aquellas infecciones oculares, que no respondan a terapia antibacteriana, antifúngica o antiviral, aunque Pearl y cols ⁽²⁹⁾ señalaban que podí­an hacerse cultivos para encontrarlas. Con base a la experiencia sugerimos que deben investigarse estas amibas, al inicio de los sí­ntomas y antes de empezar el tratamiento.

En cuanto al examen directo de la muestra, Schuster y Visvesvara ^{(3, 4)}, consideran que en el LCR, el trofozoí­to ameboide, puede confundirse con macrófagos, pero en los dos casos observados las caracterí­sticas morfológicas y el movimiento en los trofozoí­tos ameboides de Naegleria sp, no parecí­an macrófagos, pero si pueden confundirse con Acantamoeba sp. Sin embargo a pesar de que en los dos casos de MAP, observamos amibas en el examen directo del LCR, por este solo examen, no se pudo concluir el diagnóstico.

En relación con los métodos empleados examen directo y cultivo, este último arrojó mejores resultados, existiendo diferencias significativas, entre cultivar o no. Además, como en cualquier infección microbiana, el aislamiento es importante para la identificación del agente causal y como afirman Dart y cols, "el diagnóstico definitivo requiere de cultivo"� ⁽³⁰⁾ y Gatti y cols afirman que "el cultivo de Acanthamoeba de la muestra biológica es la mejor prueba, para este organismo"� ⁽³¹⁾. También, el cultivo permitió aumentar el número de trofozoí­tos y quistes, para el estudio morfológico, su medición y descripción de las caracterí­sticas, en forma estadí­sticamente significativa y realizar la prueba de flagelación, de esta manera llegamos hasta la identificación de género y fue suficiente para establecer un tratamiento, esto último según los criterios de Visvesvara ⁽³²⁾.

En la metodologí­a empleada, utilizar un medio bifásico, (agregando medio lí­quido a la placa con medio sólido), permite que el cultivo no se seque, durante el tiempo de incubación y elimina la necesidad de abrir la placa, para añadir lí­quido e impedir la deshidratación, con el consiguiente riesgo, de contaminación para el cultivo y quien lo procesa. Nos llama la atención que solo en el trabajo de Schuster ⁽⁷⁾, se menciona al microscopio invertido, para observar los cultivos, siendo un método establecido en el Laboratorio de Amibiasis desde los inicios, en la búsqueda de AVL. En el resto de lo trabajos consultados refieren que toman muestras para el examen entre lámina y laminilla. Con relación a las coloraciones si bien se recomienda en el caso del análisis de LCR, ya que permiten identificar las células del mismo diferenciando lo que no es amiba. La experiencia, permite compartir la observación de Pearl y cols. ⁽²⁹⁾ quienes señalan la dificultad de su coloración, por lo cual en trabajos recientes no se recomienda coloraciones como método útil. Particularmente notorio, son los trabajos de Schuster y Visvesvara ^{(3, 4)}, quienes hacen una amplia revisión sobre el tema y no mencionan las coloraciones. Sin embargo en su trabajos de 1.987 en el cual hacen una amplia revisión sobre la metodologí­a diagnóstica de AVL y el que comparte con Pearl y cols, si las recomendaban. 

El diagnóstico es difí­cil y que pocos laboratorios están preparados para él, incluyendo la toma y transporte de la muestra ^(4,7). Afirmaciones que podrí­an explicar el no haber encontrado registros en Venezuela, de ningún estudio sistemático de estos parásitos. Si bien la metodologí­a que probamos y recomendamos, en este trabajo, es perfectamente confiable y reproducible, es preciso implementar en el paí­s, técnicas de diagnóstico mas rápido, sobre todo ante la sospecha de MAP, que nos permitan que con la misma muestra de LCR, pudiéramos dar un diagnóstico, casi de inmediato, sobre todo si no encontramos resultados positivos, en la prueba de flagelación. En eso nos encontramos trabajando, actualmente en el Laboratorio de Amibiasis. En consecuencia compartimos la opinión de da Rocha y cols ⁽¹¹⁾, quienes señalan que el diagnóstico temprano, depende tanto de la experiencia de quien procesara la muestra, como de la toma adecuada de la misma. Además, nuestra experiencia, así­ como la referida por otros autores, nos lleva a pensar, que el equipo de salud debe actuar más temprano ya que el paciente con MAP, se confunde en los primeros sí­ntomas, con un fuerte resfriado y cuando el paciente acude al médico, se ha perdido un tiempo valioso. También ocurre el hecho de que se confunden los sí­ntomas, con otras afecciones cerebrales, dejando el diagnóstico al hallazgo no pensado de las amibas en el LCR. Tendrí­amos que relacionar los antecedentes epidemiológicos interrogados o referidos por segundas personas, con los sí­ntomas iniciales presentados por los pacientes. Además el hallazgo de Acanthamoeba sp y Naegleria sp en un paciente inmunocompetente con sinusitis ⁽³³⁾, nos alerta sobre la posibilidad de necesidad de investigarlas en estos pacientes.

Se considera que oftalmólogos y laboratorio (en nuestro caso Bioanalistas), deben trabajar en "cerrada colaboración"�, para que al cultivar se logre la identificación temprana del parásito y en consecuencia, pronto tratamiento y mejor pronóstico ^(22,31). Consideramos que esta colaboración también se extiende a todos aquellos médicos que puedan atender pacientes con sí­ntomas de afecciones cerebrales compatibles con Meningoencefalitis y Encefalitis y tales como neurólogos, infectólogos, microbiólogos, parasitólogos.

Conclusiones y recomendaciones

- Los pacientes que presentaron íšlcera Corneal por Acanthamoeba sp fueron tratados con clorhexidina-biguanida al 0,002% y/o polihexametileno-biguanida al 0,002 % y consideramos que curaron.

- El diagnóstico de estas amibas, no debe ser un evento fortuito o consecuencia del resultado negativo de la búsqueda de otros microorganismos patógenos, ante un paciente con sí­ntomas compatibles con Meningoencefalitis, Encefalitis o UC, se debe proceder desde el inicio a realizar el diagnóstico diferencial del agente causal, incluyendo las AVL.

- Se sugiere contribuir con campañas de concientización de los usuarios de lentes de contacto, sobre las medidas de higiene para protegerse de posibles afecciones oculares y difundir en la comunidad las medidas profilácticas para AVL, en el uso de aguas colectadas y lentes de contacto y de protección laboral, a fin de contribuir a la prevención de las enfermedades causadas por estas amibas.

- La metodologí­a aquí­ descrita y los presentes resultados, permiten establecer una rutina básica, para el diagnóstico de Naegleria sp y Acanthamoeba sp en afecciones del Sistema Nervioso Central y oculares, que recomendamos a neurólogos, oftalmólogos infectólogos y sobre todo a Laboratorios de Bioanálisis. Así­ como las pautas para su identificación hasta género, lo cual permitirá la aplicación de un tratamiento a tiempo mientras se desarrolla en el paí­s otra metodologí­a que cumpla con ese fin.

- Médicos, Bioanalistas y Parasitólogos, deben trabajar en "estrecha colaboración"�, para que con el cultivo se logre la identificación temprana del parásito y en consecuencia, el temprano tratamiento y mejor pronóstico.

- Los laboratorios de Bioanálisis, deben conocer a tiempo la información epidemiológica que permita orientar el diagnóstico, para actuar rápidamente, hecho imprescindible sobre todo en el caso de Naegleria fowleri, debido a la velocidad con que progresa la enfermedad producida por estas amibas.

-La metodologí­a que probamos y recomendamos, en este trabajo, es confiable y reproducible. No obstante es preciso implementar en el paí­s, técnicas de diagnóstico mas rápido, sobre todo ante la sospecha de MAP, que nos permitan que con la misma muestra de LCR, pudiéramos dar un diagnóstico, inmediato, sobre todo cuando la prueba de flagelación es negativa.

- El hallazgo de AVL, especialmente Acanthamoeba sp, en exudado nasal de portadores asintomáticos, indica la importancia de su búsqueda en ellos y su observación en el tiempo.

- Es recomendable estudiar los aislados de Acanthamoeba sp, para determinar los posibles microorganismos que puedan tener en un proceso de endosimbiosis, por la posibilidad de ser vectores de microorganismos patógenos.