El estudio fue realizado en bulbos olfatorios de ratones de la cepa Naval Medical Research Institute (NMRI), suministrados por el Bioterio Central de la Universidad de Los Andes. El manejo de los animales^(43-44), fue hecho de acuerdo a lo establecido por el Comité de Bioética de la Universidad de Los Andes para el uso de animales experimentales según exigencias establecidas en las Normas para la utilización de animales en investigación contenidas en el Código de Bioética y Seguridad del Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (FONACIT-Caracas, Venezuela).

Para lo correspondiente al análisis prenatal se utilizaron dos ratones hembras gestadas para cada edad objeto del estudio; es decir, con 13, 15, 17, 19 y 21 días de gestación (E13, E15, E17, E19 y E21) y para el estudio postnatal temprano fueron utilizados cinco ratones por cada edad: recién nacido (P0) y 1, 3, 5, 7 y 9 días de edad postnatal (P1, P3, P5, P7 y P9), los cuales fueron anestesiados con Ketamina^R a una dosis de 240 mg/Kg-peso. A las hembras de ratones con los tiempos de gestación programados, se les practicó una incisión abdominal para exponer el útero y extraer los embriones, los cuales fueron colocados inmediatamente en solución fijadora. Posteriormente, se procedió a extraer los bulbos olfatorios tanto de los embriones como de los ratones de edad postnatal, haciendo una incisión antero-posterior y otra latero-lateral en el tercio anterior del cráneo, lo cual permite la exposición de la región bulbar.

Los bulbos olfatorios, inmediatamente después de ser extraídos, fueron seccionados en fragmentos de aproximadamente 3 mm³ y sumergidos en mezcla fijadora 3:3 ⁽⁴⁵⁾ (glutaraldehído al 3% más formaldehído al 3%, en tampón cacodilato 0,1 M y pH 6,3), a 4°C, condiciones en las cuales se preservaron durante 12h; luego fueron postfijados durante 18h en tetraóxido de osmio al 1%.

Después se realizó el proceso de deshidratación e infiltración epoxídica. Utilizando un Ultramicrotomo Sorvall Porter-Blum MT2-B se hicieron secciones gruesas de 1 a 2 μm de espesor y secciones ultrafinas de 90 nm de espesor, las cuales fueron analizadas con microscopía de luz de alta resolución y microscopía electrónica de transmisión, después de haber sido contrastadas con p-fenil-endiamina y con acetato de uranilo y citrato de plomo, respectivamente^(46-48). Las observaciones se hicieron a través de un microscopio fotónico Polyvar Reichert Jung con cámara fotográfica digital Infinity y de un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7000.

Se hizo la cuantificación de los contactos interneuronales en las diferentes edades prenatales y postnatales estudiadas, desde la aparición de los primeros esbozos sinápticos hasta las sinapsis verdaderamente constituidas, tanto axo-dendríticas como dendro-dendríticas. Para valorar las diferencias estadísticamente significativas se utilizó el análisis estadístico de la varianza (ANOVA)^(49-50) y se realizó un test a posteriori para comprobar dichas diferencias, utilizando la prueba de Tukey con la aplicación del programa estadístico SPSS versión 15. Los resultados obtenidos fueron expresados en promedio de media ± Desviación Estándar (Promedio±DE), tomando el 95% como índice de confiabilidad estadística (p<0,05). Los resultados permitieron comparar el incremento en el número de sinapsis axo-dendrítica y dendro-dendríticas y la relación de estas con el desarrollo y maduración del bulbo olfatorio.