Figura 1. Bulbo olfatorio de ratón E13 destaca la uniformidad e inmadurez citológica en todo el espesor del tejido. Se observan células de núcleo voluminoso y escasas organelas en el citoplasma. Aumento: 63 X

El bulbo olfatorio entre los días E15 y E17 empieza a mostrar su histoarquitectura característica. Presenta un límite externo regular y bien delineado, la población celular muestra el inicio de la diferenciación morfológica, mostrando cierto grado de laminación, distinguiéndose al día E15 tres segmentos celulares: el más externo con células pequeñas, de morfología variada, aunque tienden a la elongación somática, en el segundo segmento se ven células de mayor volumen somático, con núcleo grande y abundante citoplasma; mientras que en la parte más interna las células son redondeadas con núcleos grandes y escaso citoplasma distribuidas entre una neuropila que empieza a formarse (Figura. 2).

Figura 2. Sección de bulbo olfatorio de ratón E15 se observa el inicio de la laminación tisular. La parte periférica (a) está formada por células de morfología, variada, algunas con amplio citoplasma. En la zona interna (b) las células tienden a ser redondeadas con núcleos grandes y escaso citoplasma. En la parte intermedia se observan células que destacan por su mayor volumen somático y nuclear (flecha). Aumento: 25 X.

Al día E17 entre los cuerpos celulares se distinguen prolongaciones neuronales inmaduras, en las cuales es posible observar múltiples formaciones vesiculares de diferentes tamaños y entre estas algunas semejantes a vesículas sinápticas, además, a esta edad es posible ver la presencia, en un número muy reducido, de pequeños depósitos de material electrón denso adosados a la cara interna de membrana de las prolongaciones celulares (Figura. 3), que pueden ser interpretados como los primeros contactos intermembranosos y por tanto, el inicio del proceso sináptico en la especie estudiada.

Figura 3. Prolongaciones neuronales observadas en la región plexiforme del bulbo olfatorio de ratón E17, en cuyo interior destaca la presencia de formaciones vesiculares (flechas rectas) y en algunos sitios de contacto entre las prolongaciones se observa depósito de material electrón denso (flechas curvas). Aumento: 18.000 X.

Luego a la edad E19 se va perdiendo la regularidad y uniformidad del borde periférico del bulbo debido a la presencia de las primeras fibras del nervio olfatorio que ingresan al mismo en forma de delgadas prolongaciones electrón densas que ocupan la zona próxima al borde, distribuyéndose tanto de forma paralela al mismo, como ramificándose perpendicularmente hacia el interior del tejido para dar inicio a los futuros glomérulos. La parte más periférica del bulbo olfatorio, a esta edad se observa diferenciada en dos segmentos, uno externo donde la celularidad para iniciar su transformación en una verdadera capa plexiforme y uno interno, con un alto índice de cuerpos celulares, donde destacan las células en penacho que son de mayor volumen que el resto de la población neuronal. Por debajo de esta capa se observa la presencia de grandes células elongadas, de citoplasma claro y núcleo grande, dispuestas en varias capas, que corresponden a las células mitrales y hacia la parte más interna se observa la capa bien constituida de células granulosas (Figura. 4).

Figura 4. Se observa la irregularidad de la periferia del bulbo olfatorio de ratón a la edad E19, debido al ingreso de las fibras del nervio olfatorio (flechas cortas) a la capa plexiforme (cp), donde puede observarse una incipiente formación glomerular (flecha curva). Debajo de esta capa plexiforme se visualizan grandes células elongadas, de citoplasma claro y núcleo voluminoso, dispuestas en varias capas, que corresponden a las células mitrales (CM). cg, capa de células granulosas. Aumento: 20 X.

Al día E21 la región más periférica del bulbo olfatorio muestra una proporcionalidad semejante de cuerpos celulares del tipo de interneuronas y de prolongaciones neuronales; sin embargo, al alejarse del borde el tejido se hace más laxo y se observa un aumento en la cantidad de formaciones glomerulares, a pesar de que todavía no están bien conformadas y que son producto de la interrelación entre las prolongaciones neuronales del bulbo y entre estas y las fibras del nervio olfatorio (Figuras. 5 y 6).

Figura 5. Detalles de la interacción entre las fibras del nervio olfatorio (cabezas de flecha) con los elementos neuronales (asteriscos) del bulbo olfatorio en ratón E21, para formar los glomérulos (flechas curvas). Células en penacho (flechas rectas); CPG, células periglomerulares. Aumento: 40X.

Al observar el bulbo olfatorio de ratones P1 llama la atención la presencia de largas, aunque escasas, prolongaciones neuronales de mediana densidad electrónica, que corresponden a dendritas de células mitrales, algunas de las cuales se extienden hasta los límites donde están ubicados los glomérulos. Se observa cómo han disminuido tanto la celularidad en la zona más externa del bulbo que prácticamente está ocupada solamente por trayectos neuronales, como la distancia entre los glomérulos y el conjunto de cuerpos de las células mitrales, segmento bulbar donde se visualizan cuerpos de células mitrales que aun no han alcanzado su topotípia y algunas células en penacho (Figura. 7).

Figura 7. Día P1, se observan trayectos neuronales horizontales (asterisco) en la parte más periférica e inmediatamente hacia el interior se ven formaciones glomerulares (cabezas de flecha) hacia donde convergen prolongaciones dendríticas (flechas rectas) de las células mitrales (CM). Aumento : 40 X.

Mientras que al día P3 la mayoría de las células mitrales han descendido hasta ocupar su sitio definitivo y sus prolongaciones dendríticas se hacen más delgadas, alargadas y ramificadas, observándose células en penacho y células periglomerulares entremezcladas con esas prolongaciones (Figura. 8).

Figura 8. Segmento de bulbo olfatorio de ratón P3 donde se aprecia una amplia capa plexiforme (cp), formaciones glomerulares (cabezas de flecha), la capa de células mitrales (CM) y la capa de células granulosas (cg). Aumento: 25 X.

Es de destacar que a la edad P3, en la zona periférica se pueden observar trayectos descendientes del nervio olfatorio, que al ramificarse para formar los glomérulos se dirigen en sentido transversal y/u oblicuo; sin embargo, más profundamente ya se visualizan zonas de neuropila donde se puede observar que gran parte de las prolongaciones neuronales poseen en su interior vesículas del tipo sináptico (Figura.9), presentando algunas terminaciones neuronales, engrosamientos de membrana y en oportunidades se pueden distinguir contactos sinápticos dendro-dendríticos en formación (Figura. 10).

Figura 9. Detalle de la capa plexiforme de bulbo olfatorio de ratón P3. Se observan formaciones vesiculares en el interior de las prolongaciones neuronales y en algunos sitios se observa engrosamiento de las membranas (flechas). Aumento: 18.000 X.

Figura 10. Conjunto de prolongaciones dendríticas (d) en bulbo olfatorio P3, observándose entre dos de ellas el inicio de la formación inicial de un contacto interneuronal (flecha). Aumento: 18.000 X.

Al día P5 el bulbo olfatorio de la especie estudiada ya tiene una organización tisular definida y las células presentan un alto porcentaje de sus características propias. Las células periglomerulares ubicadas en proximidad de los glomérulos, son células de baja densidad electrónica, con escaso citoplasma y núcleo grande. Las células en penacho de cuerpo grande, núcleo voluminoso y citoplasma de baja densidad electrónica, se localizan en la mitad inferior de la capa plexiforme. Al aumentar el bulbo olfatorio de volumen y tamaño, las células mitrales modifican su distribución multilaminar y al día P5 sus cuerpos forman una monocapa o una bicapa celular, sus prolongaciones dendríticas que iniciaron su verticalización a partir del día P0 y P1, se hacen más gruesas, alargadas y ramificadas y se distribuyen en todo el espesor de la capa plexiforme (Figura. 11), que al integrarse conjuntamente con las fibras olfatorias y las dendritas de las células en penacho, participan en la formación de los glomérulos (Figs. 11 y 12), en cuyo interior ya es notoria la presencia de contactos sinápticos axo-dendríticos y dendro-dendríticos (Figura.12). Distribuidas en todo el espesor de la capa plexiforme y entre los cuerpos de las células mitrales, es frecuente observar interneuronas.

Figura 11. Al día P5 el bulbo olfatorio de ratón muestra características de madurez organizacional. Se observan trayectos claros de dendritas (flechas rectas) de las células mitrales (CM) y de las células en penacho (cabezas de flecha), células periglomerulares (CPG) y en la parte superior un segmento de un glomérulo (flecha curva). cg, capa de células granulosas. Aumento: 25 X.

Figura 12. Sección de glomérulo de bulbo olfatorio de ratón P5 donde se distinguen prolongaciones dendríticas neuronales (d) y fibras terminales del nervio olfatorio (asteriscos). Se pueden visualizar contactos sinápticos axo-dendríticos y dendro-dendríticos. Aumento: 10.000 X.

Todas las características observadas en el día P5 se consolidan y se hacen definitivas al día P7 de desarrollo postnatal, edad en la cual toda la población celular del bulbo olfatorio ha alcanzado su citotipia e histotipia, observándose una bien definida organización de los glomérulos, los cuales tienden a hacerse más periféricos y posteriormente aumentan de tamaño hasta adoptar en la mayoría de los casos su forma esferoidal (Figura. 13).

Figura 13. Se muestra la citotipia y la histotipia del bulbo olfatorio al día P7. Aumento : 20X.

Figura 14. Contactos sinápticos dendro-dendríticos y axo-dendríticos observados al día P7 en el bulbo olfatorio de ratón. d, dendritas; ax, axones. Aumento: a, 25.000X; b, 20.000X.

En los días P7 (Figura. 14) y P9 los contactos sinápticos tienen todas sus características de madurez morfológica tanto los axo-dendríticos como los contactos dendro-dendríticos y su presencia es cuantitativamente más elevada en relación a las edades previas (Figura. 15, Tablas 1 - 4).

Figura 15. Cuantificación, por µm² de superficie, de sinapsis axo-dendríticas y dendro-dendríticas en el bulbo olfatorio de ratón en edad prenatal tardía y postnatal temprana.

Tabla 1. Variabilidad en el número de sinapsis dendro-dendríticas en el bulbo olfatorio de ratón en edades postnatales tempranas (n = 50).

Tabla 2. Comparaciones múltiples de los promedios de las medias en el número de sinapsis dendro-dendríticas utilizando la Prueba de Tukey (n = 50).

Tabla 3. Variabilidad en el número de sinapsis axo-dendríticas en el bulbo olfatorio de ratón en edades prenatal tardía y postnatal temprana (n = 50).

Tabla 4. Comparaciones múltiples de los promedios de las medias en el número de sinapsis axo-dendríticas utilizando la Prueba de Tukey (n = 50).

El análisis estadístico realizado al número de sinapsis dendro-dendríticas en el bulbo olfatorio durante el desarrollo postnatal (P3- P9), dio un nivel de significancia de p=0,000, lo cual significa que hay una diferencia estadísticamente muy significativa entre las edades estudiadas ya que p<0,05 (Tabla 1). Cuando analizamos el test a posteriori (Tabla 2) encontramos que los promedios en el número de sinapsis dendro-dendríticas, son diferentes con respecto a cada edad, lo que indica que existen diferencias estadísticamente significativas en el número de contactos sinápticos en las edades estudiadas. En la figura 15 se muestra en forma gráfica el aumento en el número de sinapsis dendro-dendríticas en el bulbo olfatorio de ratón entre P3 y P9. Se puede observar que hay un aumento constante en el número de sinapsis durante el período de desarrollo analizado.

Los resultados obtenidos después del análisis estadístico con ANOVA (Tabla 3) del número de sinapsis axo-dendríticas en el bulbo olfatorio de ratón desde E17 hasta P9, reflejaron un valor de p=0,000, lo cual indica que hay diferencias muy significativas en el número de sinapsis axo-dendríticas en las edades estudiadas. Al comparar con el test a posteriori (Tabla 4), se observa que los valores obtenidos en las edades E17 y desde P1 a P9 muestran una diferencia estadísticamente significativa, mientras que entre las edades entre E19 a P0 no se observaron diferencias estadísticamente significativas. Durante la etapa prenatal E17 a E21 el crecimiento en el número de sinapsis axo-dendríticas es muy lento y tiende a ser constante. Es a partir de P0 y P1 cuando se observa un leve aumento en el número de formaciones sinápticas. Como se observa en la figura 15 el aumento real del número de sinapsis axo-dendríticas comienza a partir de P1 y este incremento se hace constante y progresivo hasta P9, última edad analizada en este trabajo.

De los resultados obtenidos tanto del promedio de las medias en el número de sinapsis axo-dendríticas como de las dendro-dendríticas, se puede inferir que la formación principal de ambos tipos de sinapsis comienza durante el desarrollo postnatal, es decir, entre las edades P3 y P9.