El material de estudio estuvo constituido por exoproductos de cinco cepas de Pseudomonas aeruginosa, aisladas de pacientes con diferentes cuadros clínicos (31). Las muestras de sangre para la obtención de los sueros tanto de los pacientes con patología infecciosa (Tabla 1) como de los controles sanos sin historia de infección por este microorganismo, se llevaron a cabo siguiendo las normas del código de Bioética y Bioseguridad del Fonacit (32).

- Immunoblotting (Inmunotransferencia).

En una primera fase se separaron los antígenos excretados en medio líquido por P. aeruginosa (31) mediante electroforesis en gel SDS-poliacrilamida al 10%, siguiendo el método de Laemmli (33). En el gel preparativo de un solo pozo de 7,35 cm. de largo y 1,5 mm. de ancho se colocó en buffer de disociación, 25µl de cada muestra conteniendo 2.000 µg. de proteínas. Los controles de Peso Molecular fueron: Albúmina bovina (66.000 D), Ovoalbumina (45.000 D), Anhidrasa carbónica (31.000 D) y Lisozima (31.000 D) (Bio-Rad). Los pesos moleculares de las diversas bandas proteicas fueron calculados con una curva de regresión lineal (Quantity One Gel Documentation System-Bio-Rad). La electroforesis se realizó en un aparato Miniprotean III (Bio-Rad), a 100 voltios y a temperatura ambiente durante un período aproximado de 3 horas. Posteriormente se extrajo el gel, y del mismo se separó la porción que contenía los controles de Peso Molecular y una parte de la muestra, se fijó con etanol 30%-ACoH 7% y se coloreó con Comassie brillant blue al 0,05%. El resto del gel se usó para la transferencia de la muestra al papel de nitrocelulosa, el cual se realizó en la cámara Mini-trans-blot de electroforesis de transferencia (Bio-Rad). Después, se retiró el gel se coloreó con Comassie brillante blue al 0,05% para comprobar la eficacia de la transferencia. El papel de nitrocelulosa se incubó con albúmina sérica bovina (SAB) al 3% (p/v) en solución salina 0.85% (p/v), por un período de una hora a 37ºC. Seguidamente, se realizaron 5 lavados con buffer (Tween 20, 0,1% en PBS), por 20 minutos c/u, con agitación constante y a temperatura ambiente, se cortó el papel de nitrocelulosa en tiras de aproximadamente 3 mm. de ancho y a cada una se le agregaron 2,5 ml. de los diferentes sueros, diluidos a 1:50 con buffer de bloqueo (BSA 3% y Tween 20, 0,05% en solución salina) y se incubaron durante toda la noche a 4ºC con agitación constante. Posteriormente, las tiras se lavaron cinco veces por 20 minutos, con agitación constante con solución de PBS al 0,1% de Tween 20, luego se incubaron con 1 ml de solución de (Fab')₂ anti-inmunoglobulina humana peroxidasa (Amersham) diluída 1:500 en buffer de lavado, durante toda la noche a 4ºC y con agitación constante. Luego se realizaron nuevos lavados en iguales condiciones que los anteriores en 10 ml de solución salina conteniendo 5 mg. de Diamino benzidina (Sigma), 10 ml. de peróxido de hidrógeno y 0.3 ml. de CoCl₂ al 1% (p/v) en agua destilada, por un tiempo aproximado de 5 minutos o hasta iniciarse la aparición de las bandas, momento en que se detuvo la reacción para posteriormente tomar las fotografías.