Fisiología
Modelo matemático unidimensional del efecto de la Calmodulina y SERCA en la difusión del Ca2+ citosólico en una célula de músculo liso.
Resultados y discusión
1.Difusión Pura con condición inicial c(t0)= 0 mol/m3
Nuestro primer experimento lo realizamos sin liberación impulsiva de Ca2+, verificamos que al no existir gradiente de concentración (porque no hay liberación de Ca2+ a través de ningún canal de RyR entonces la concentración citosólica permanecerá invariable, igual a cbasal) no existe difusión como lo predice la Ley de Fick(18). Por otro lado, este experimento permite comprobar parcialmente el adecuado funcionamiento del paquete computacional utilizado.
2. Difusión Pura (Sin presencia de: Calmodulina, JFUGA y JSERCA) con el disparo del canal central de RyR en t = 0 s.
En este experimento se muestra la difusión pura para una liberación inicial impulsiva tipo gaussiana, que representa el ingreso de Ca2+ al citosol desde un canal localizado en la mitad del dominio (x = 1µm) para t = 0 s; se puede observar en la Figura 3B que la gráficas para la concentración del ión en función de la posición y el tiempo, tienen un comportamiento similar al encontrado para la solución analítica(18) de la ecuación de difusión pura con condición inicial c(x,0) = δ(x-x0) y dominio infinito (Fig. 4B), aún cuando en este trabajo se resolvió la ecuación de difusión para un dominio finito, estas soluciones son similares debido a que la dispersión de la gausiana (σx) que representa el disparo inicial cumple con la condición (σx/L) <<1, más exactamente, los puntos alejados del centro de la gaussiana (centro del canal de RyR) no están influidos por la liberación impulsiva de Ca2+ sino cuando ha transcurrido un tiempo muy largo.
La Figura 3C nos muestra que la difusión alcanza su estado estacionario (EE) luego de aproximadamente 3 ms de iniciado el disparo, y que la concentración de Ca2+ en el citosol (≈1,7.10-4 [mol/m3]) está por encima de la concentración basal (1,19.10-4 [mol/m3]). Por esta razón se deberá incluir en nuestro modelo el flujo de SERCA (JSERCA) y el flujo de FUGA (JFUGA), los cuales sumados evitan que una vez alcanzada la concentración basal de [Ca2+] disminuya. También podemos observar que el tiempo que tarda la difusión en alcanzar un estado estacionario (3 ms), es muy corto en comparación con el tiempo de duración del “spark” de Ca2+ encontrado en el músculo liso (guinea pig) por microscopía confocal(19), el cual está entre 150 y340 ms(20). La corta duración de la difusión encontrada por nosotros se debe al hecho (como se demostrará luego) de no haber considerado la acción del buffer Calmodulina.
Obsérvese que la escala de tiempo usada para evidenciarlos los cambios en la concentración citosólica de Ca2+ en puntos alejados del sitio de liberación es 10 veces más grande (10-4s) que la usada para evidenciar los cambios en locaciones más cercanas al sitio de liberación (10-5s).
Figura 3. A: Difusión Pura para el disparo del canal central de RyR en t = 0s. No está presente la Calmodulina. Concentración en función de la Posición y del Tiempo. B: Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. C: Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio.
Respecto al cambio de la concentración citosólica de Ca2+ se pasa de la concentración basal (1,19.10-4 [mol/m3]) a un pico de concentración en el sitio de la liberación de 2,11.10-3 [mol/m3], es decir, aproximadamente 17 veces mayor que la concentración basal; después de alcanzado el EE se observa que la concentración citosólica es aproximadamente 1,4 veces mayor que la concentración basal.
Las Figuras 4 A,B,C son gráficos de la solución analítica de la Ecuación de Difusión Pura para un dominio infinito, condiciones de borde tipo Dirichlet y liberación impulsiva en el centro del intervalo. La similitud morfológica con las Figuras 3 A,B,C es evidente, no obstante, que estas últimas representan gráficos de la solución numérica para un dominio finito con condiciones de Neumann (flujo nulo de iones calcio en los extremos del intervalo de difusión). Debido a que se han utilizado coeficientes de Difusión y cantidad de iones calcio liberados al citosol diferentes, la escala temporal difiere en varios órdenes de magnitud.
Figura 4 A. Solución analítica de la ecuación difusión pura. Concentración en función de la Posición y del Tiempo. B. Concentración Vs Posición para diferentes Tiempos. C. Concentración Vs Tiempo para diferentes puntos del dominio.
3. Difusión-Reacción con: i) Disparo del canal central de RyR en t=0 s, ii) Acción de la Calmodulina (40, 30 y 10mM) y Def = Dc / (1+ ϴ), iii) Acción simultánea de JSERCA y JFUGA.
Con una concentración citosólica de Calmodulina igual a 40 mM, el comportamiento de la concentración del ión Ca2+ debido a la liberación de Ca2+ desde un único canal de RyR central (x=1µm), considerando la acción de la Calmodulina y el efecto de JSERCA y JFUGA, observamos que el tiempo para alcanzar el EE es del orden de 300 ms (Figura 6C). Las concentraciones en los puntos cercanos y alejados del canal alcanzan su máximo por debajo de los 50 ms. Existe un buen acuerdo entre el tiempo para alcanzar el EE obtenido en este experimento y los valores publicados previamente para la duración de un “spark”(21,22) de músculo liso(20) (Ver Figura 5) . Para concentraciones de Calmodulina inferiores a 40 mM, por ejemplo, 30mM, el tiempo para alcanzar el EE es del orden de 200 ms (Figura 6E) y para 10mM es del orden de 90 ms (Figura 6D), lo cual evidencia el efecto retardador sobre la difusión de la Calmodulina.
 Figura 5: Evolución temporal de [Ca2+] obtenida con microscopía confocal de barrido para diversas locaciones. FUENTE: Gordienko, D., Bolton, T., Cannell, M. Variability in spontaneus subcellular calcium release in guinea-pig ileum smooth muscle cells. J. Physiol 507. No. 3 (1998) pp 707-720.
Figura 6. A. Concentración de Calmodulina 40 mM. Difusión-Reacción para el disparo del canal central de RyR y la acción de Jserca y Jfuga. Concentración en función de la Posición y del Tiempo. B. Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. C. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio. D: Concentración de Calmodulina de 10 mM. Difusión-Reacción para el disparo del canal central de RyR y la acción de Jserca y Jfuga. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio. E: Concentración de Calmodulina de 30µM Difusión-Reacción para el disparo del canal central de RyR y la acción de Jserca y Jfuga,. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio.
4. Difusión-Reacción con i) disparo de un segundo canal de RyR por la acción de la difusión de Ca2+ luego del disparo del canal central en t=0 s, ii) Calmodulina (40 mM) y Def = Dc / (1+ ϴ), iii) Acción simultánea de JSERCA y JFUGA.
El disparo de un canal de RyR puede activar el disparo de otros canales de RyR cercanos los cuales son más sensibles a los cambios de la [Ca2+] que el canal central (es un hallazgo experimental), es decir, los receptores RyR laterales se disparan con un umbral de concentración de Ca2+ menor (y también liberan menor cantidad de Ca2+ al citosol). En este experimento definimos un umbral de concentración para el segundo canal de RyR ubicado en x=0.5µm, como el máximo valor de la concentración de Ca2+ alcanzando en el proceso de difusión para un solo canal central de RyR, en la posición del segundo canal, lo cual ocurre para t = 15ms. Ver Figura 7.
Figura 7: Concentración Vs Tiempo en x = 0.5 µm. Difusión del disparo en t = 0 del canal central de RyR
En la Figura 8C, se puede observar que la línea verde (x = 0.5µm) inicialmente no se hace evidente porque tiene superpuesta la línea azul clara (x = 1.5µm) ya que estas locaciones se encuentran equidistantes del centro y por lo tanto la concentración tiene idénticos valores debido al carácter simétrico de la difusión desde el canal central, luego se observa que el canal de RyR en x = 0.5µm es activado en el momento en el cual la concentración alcanza su máximo. Cuando el segundo canal deja de liberar Ca2+, el proceso de difusión y la acción de JSERCA disminuyen rápidamente el valor de la [Ca2+] en la locación x = 0.5µm. Se observa también que para locaciones alejadas del segundo canal (1.5µm y 1.75µm) el disparo del segundo canal no afecta de manera significativa la [Ca2+] lo cual se debe a la acción de JSERCA que va atenuando el incremento de la concentración debido a este segundo disparo. Se observa que para el punto x =0.75µm ubicado entre los RyR1y RyR2, está presente una oscilación en la [Ca2+].
Figura 8. A. Difusión-Reacción para el disparo de un canal de RyR activado por la difusión del disparo del canal central en t = 0seg. Concentración en función de la Posición y del Tiempo. B. Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. C. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio
5.Difusión-Reacción con i) Representación del disparo de dos canales de RyR por la acción de la difusión de Ca2+ luego de un disparo inicial en t = 0 s, ii) Calmodulina (40mM) y Def = Dc / (1+ ϴ),iii)Acción simultánea de JSERCA y JFUGA.
En este experimento (Figura 8), observamos el disparo de un canal de RyR central (x = 1µm; 2,1mmol/m3) en t = 0s, seguido del disparo de dos canales de RyR laterales (x = 0.5µm y x = 1.5µm) de menor intensidad (1,1mmol/m3) ambos en t=0,015s. En x = 1.5µm (sobre el tercer canal de RyR), ocurre un aumento leve de la [Ca2+], después se aprecia un aumento brusco de la misma debido al segundo disparo. Se observa que para x = 0.75µm (entre los canales 1 y 2 de RyR) la concentración aumenta por el disparo del primer canal, luego decae por acción de JSERCA y la difusión, luego vuelve a aumentar producto del segundo disparo del canal de RyR de menor intensidad, dando como resultado una oscilación de concentración que luego decae al valor basal. El mismo comportamiento ocurre para x = 1,75 µm, aumenta levemente por la acción del disparo del primer canal (por estar este punto más alejado del canal de mayor intensidad) y luego aumenta por acción del disparo del tercer canal, para finalmente decaer hasta la concentración basal.
6. Difusión-Reacción con i) disparo de tres canales de RyR, el canal central activado en t = 0 s, luego el segundo canal se dispara en t = 0.015s y en x = 0.5µm y el tercer canal se dispara en t = 0.040s y en x = 1.5µm, ii) Def = Dc / (1+ ϴ), iii)Acción simultánea de JSERCA y JFUGA.
En la Figura 10 C puede apreciarse la curva de concentración vs tiempo para x = 0.5µm (línea verde) la cual en la Figura 9 C, no se observa por la superposición con la línea azul claro ya mencionada. Si los canales 2 y 3 de RyR son activados en tiempos diferentes los valores máximos de la concentración son diferentes (Gráfico 10C), esto se debe a la acción de JSERCA, ya que en el instante en que se activa el canal 3 (x = 1.5µm) el valor de [Ca2+] está por debajo del valor que tenía la [Ca2+] en el momento de activación del canal 2 (x = 0.5µm). Al igual que en el experimento anterior, existen puntos en el dominio (x=0,75µm y x=1,75µm) donde se observan oscilaciones debido a disparos subsiguientes de los canales de RyR cerca del punto de observación. Estas oscilaciones son de menor amplitud cuando la concentración de Calmodulina disminuye desde 40 mM hasta 30 mM (Fig.11B) y 10 mM (Fig. 12B).
Figura 9. A. Difusión-Reacción para el disparo de dos canales de RyR activados por la difusión del disparo del canal central en t = 0 s. Concentración en función de la Posición y del Tiempo. B. Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. C.Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio.
Figura 10. A. Concentración de Calmodulina de 40 mM. Difusión-Reacción para el disparo de tres canales de RyR activados en tiempos diferentes. Concentración en función de la Posición y del Tiempo. B. Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. C. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio.
Figura 11. A. Difusión-Reacción para el disparo de tres canales de RyR. Concentración de Calmodulina de 30µM. Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. B. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio. 
Figura12. A. Difusión-Reacción para el disparo de tres canales de RyR; Concentración de Calmodulina 10µM. Concentración vs Posición, en tiempos diferentes. B. Concentración vs Tiempo, en puntos diferentes del dominio.
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