El estudio está enmarcado en una investigación de tipo descriptivo correlacional, de corte transversal, prospectivo y con un diseño no experimental ^(19,20). La población estuvo representada por 141 aislados de Staphylococcus aureus, de las cuales 64 provenían de portadores asintomáticos y 77 de procedencia infecciosa, estos aislados fueron recolectados posterior a la permisología otorgada por el Laboratorio de Diagnóstico Bacteriológico del Departamento de Microbiología de la Universidad de Carabobo y por el Laboratorio Clínico La Viña (Centro Médico Privado, Valencia, Venezuela) respectivamente, entre mayo-noviembre del año 2013, cumpliéndose con el requisito del consentimiento informado de los pacientes involucrados. La muestra estuvo constituida por el total de las cepas que conformó la población.

Una vez recolectados los aislados de S. aureus provenientes de portadores asintomáticos y de procesos infecciosos, se realizaron las pruebas bioquímicas convencionales para confirmar su identificación como lo describe la literatura ⁽²¹⁾. Posteriormente se conservaron en la bacterioteca hasta agotar el tiempo establecido de recolección, seguidamente se procedió a repicar las bacterias almacenadas en caldo BHI (Infusión Cerebro Corazón) y luego en agar manitol salado, con la finalidad de obtener cepas frescas o recién cultivadas.

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana

De colonias aisladas, se preparó una suspensión bacteriana ajustada al patrón 0,5% Mc Farland equivalente a 1.5 x 10⁸UFC/mL, en solución salina fisiológica con el cual se ejecutó la prueba de susceptibilidad antimicrobiana por el método cualitativo Kirby Bauer. Se usaron discos de sensibilidad marca BD BBL^R de oxacilina (OX: 1 µg) y cefoxitín (FOX: 30 µg), para detectar cepas de S. aureus resistentes a meticilina (SARM), clindamicina (CC: 2 µg ) y eritromicina (E: 15 µg) teniendo en cuenta la colocación frente a frente de estos discos para realizar el D-test, con la finalidad de evidenciar cepas con resistencia a macrólidos y lincosamidas de los siguientes fenotipo: 1) cMLS_B resistencia constitutiva a E y CC (D-test negativo), 2) MS_B resistencia constitutiva a E y sensible a CC sin achatamiento (D-test negativo) y 3) iMLS_B resistencia a E y sensible a CC con achatamiento (D-test positivo), resistencia exclusiva a lincosamidas por presencia de enzimas nucleotidiltransferasas (E- Lnu) poco frecuente. Finalmente para la detección de cepas con resistencia a vancomicina (VRSA) y cepas con resistencia intermedia a vancomicina (VISA), se utilizó el método de dilución en Agar BHI suplementado con 6 µL/mL de vancomicina (CMI ≥ 8µL/mL) y método de dilución en caldo en (CMI ≤ a 4µL/mL). Todas las lecturas se interpretaron según los criterios establecidos por la CLSI (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio) ^(11,22).

Para evaluar el buen funcionamiento de los discos de antibióticos y del Agar Muller Hinton se utilizó la cepa de referencia S. aureus ATCC 25923 adquirida en el Centro Venezolano de Colección de Microorganismos, cuyos halos fueron comparados con los rangos establecidos por la CLSI. Para evaluar el agar BHI suplementado con vancomicina se utilizaron las cepas de referencia Enterococcus faecalis ATCC 29212 y ATCC 51299 ^(22,23).

Una vez obtenidas las lecturas se clasificaron las cepas en dos grandes grupos, un primer grupo constituido por cepas sensibles a todos los antibióticos mencionados y un segundo grupo que estuvo conformado por cepas resistentes a al menos un antibiótico o más, con los cuales se realizó la asociación en cuanto a la formación de biopelículas en ambos grupos.

Cuantificación de la capacidad de formación de biopelículas

Se efectuó mediante la técnica de microplaca en pozos de poliestireno (método colorimétrico) descrita por Al-Shuneigat et al. citado en Rojas y col (2012). Se preparó una suspensión bacteriana ajustada al patrón 0,5% Mc Farland en caldo soya tripticasa. De esta suspensión se dispensó 20 μL en cada pozo, más 180 μL de caldo soya tripticasa con glucosa al 0,25% (dilución 1:10) para luego incubar en cámara húmeda por 24 horas a 37°C. Pasada la incubación, en cada pozo se realizaron dos lavados con solución buffer fosfato salino estéril (PBS, pH 7,2). Se añadieron 200 μL de solución de cristal violeta al 0,01 % manteniéndose a temperatura ambiente por 30 min y posteriormente se realizaron dos nuevos lavados con solución PBS. Seguido a esto se adicionó 200 μL de etanol al 95% para solubilizar el colorante adherido a las paredes, cuantificándose su densidad óptica (DO) como una estimación de la capacidad de formación de biopelículas, la medición se realizó a 490 nm utilizando un lector de micro ELISA (Stat Fax 303 Plus) ⁽²⁴⁾.

Cada aislado se evaluó por cuadruplicado, incluyendo en cada ensayo ocho pozos sin inocular interpretándose estos como controles negativos y adicionalmente se introdujeron ocho pozos con aislados conocidos por sus altas capacidades de formación de biopelículas tomados de la bacterioteca del Laboratorio de Diagnóstico Bacteriológico (cuatro pozos para Klebsiella pneumoniae y cuatro pozos para Pseudomonas aeruginosa), estos últimos se interpretaron como controles positivos.

Para la clasificación de cada aislado, en cuanto a su capacidad de formación de biopelículas, se utilizaron ecuaciones matemáticas que contiene la DO de los pozos control negativo como lo cita Rojas y col, adicionándose una variante que incluye la DO de los controles positivos tal como sigue: se calculó la media aritmética () de las DO obtenidas a 490nm de los controles positivos y de los controles negativos para ser utilizados en las siguientes tres fórmulas:

VM: DOc (+) – DOc (-)/2

PC1: VM – DOc(-)/2 + DOc (-)

PC2: DOc(+) –VM/2 + VM

Donde las siglas significan:

VM: valor medio; DOc (+):() de las densidades óptica a 490 nm de los controles positivos; DOc (-): () de las densidades ópticas a 490 nm de los controles negativos; PC1: primer punto de corte; PC2:segundo punto de corte.

A partir de los valores de VM, PC1 y PC2 obtenidos se establecieron los rangos para la clasificación de la capacidad de formación de biopelículas en cuatro categorías: fuerte, moderada, débil y no formadora. Interpretado de la siguiente manera: serán no formadoras cuando los valores se ubiquen entre la DOc (-) hasta cifras ≤ PC1, débilmente formadora cuando los valores se encuentren > PC1 ≤ VM, moderadamente formadoras cuando los valores sean > VM ≤ PC2 y fuertemente formadora con valores > PC2.

Análisis de los datos

El análisis descriptivo de los datos se expresó mediante tablas y gráficos de barra en porcentaje. Por otra parte, la asociación de la capacidad de formación de biopelículas con la susceptibilidad antimicrobiana y con la procedencia clínica se efectuó mediante la prueba Chi² de Pearson, con un nivel de confianza de 95 %.