Diseño del frotis
sanguíneo virtual
Se elaboraron frotis sanguíneos en láminas portaobjetos de
una muestra obtenida de un paciente, por punción venosa en condiciones de
asepsia, mediante un sistema de tubos al vacío con K2EDTA como
anticoagulante (BD, USA), siguiendo los lineamientos bioéticos del protocolo de
Helsinki. Los frotis fueron fijados con metanol y coloreados con tinción de
Wright acuosa empleando el coloreador Aerospray (WESCOR, USA), siguiendo el
procedimiento interno “elaboración de frotis sanguíneos” y los “criterios de
calidad” establecidos (13,14). Para la digitalización se utilizaron
los frotis con la mejor calidad de distribución, coloración y campos
apropiados.
Se seleccionó un área del frotis sanguíneo con
una distribución homogénea de los elementos formes y con un número de
leucocitos mayor a 120, esta área fue digitalizada empleando un microscopio
Olympus BX2 con cámara fotográfica digital DP25 (Olympus, Japón). Se tomaron de
forma secuencial y sistemática fotografías de tamaño 1360 x 1024 píxeles (px),
en formato PNG, de un tamaño aproximado de 2,5 Megabyte (MB). Se empleó un
objetivo de 20X, para un aumento total de 200x. El área seleccionada, de
aproximadamente 2 x 2 milímetros, se digitalizó inicialmente mediante un
barrido horizontal (eje x) de la platina manual, tomando fotografías a una
distancia entre sí de 0,3 mm, para luego mover la platina de forma vertical 0,2
mm (eje y) y realizar la captura de éste eje en forma horizontal. La secuencia
de movimientos fue realizada hasta completar el área a digitalizar. El
solapamiento de las fotos entre sí fue de aproximadamente el 40%.
Cada barrido horizontal del área digitalizada fue
reconstruido uniendo las imágenes de la secuencia, luego se unieron las filas
horizontales, hasta reconstruir de manera digital el área capturada. Fueron
eliminados los excesos laterales (generados por un sesgo en el movimiento de la
platina manual empleada) a fin de obtener un rectángulo. La imagen final fue
almacenada en formato PNG.
El solapamiento de las imágenes generó en algunas zonas del
frotis dos efectos indeseables, ausentes en el frotis físico: a) un fondo de
frotis heterogéneo en cuanto al color, con cambios abruptos de tonalidad, que
fue corregido unificado el color de fondo a una tonalidad clara, seleccionada
de la misma foto; b) generación de “quimeras digitales”, formadas por uniones
incompletas de glóbulos rojos que generaban elementos abstractos e irreales, y
eran producto del solapamiento que se dio al unir las fotografías primero
horizontalmente y luego verticalmente. Cada una de estas quimeras fue borrada
de la imagen.
La imagen limpia del frotis digital fue dividida en
porciones más pequeñas, a fin de facilitar su uso por parte de los navegadores
de internet. Primero se dividió la imagen en porciones de 4.000 x 4.000 px y
cada una de éstas se dividió en 16 imágenes de 1.000 x 1.000 px
aproximadamente, guardadas en formato JPG de máxima calidad. Para el
tratamiento de las imágenes se empleó el software Photoshop CS3 (Adobe, USA).
Para reconstruir el frotis digital fragmentado, se
creó una tabla en formato html, donde cada una de las fotografías de 1.000 x
1.000 px ocupa una celda. El archivo fue llamado “fotos.html”. Las fotografías
fueron almacenadas en una carpeta denominada “imagenes”. Para completar el frotis sanguíneo
virtual, se diseñó y creó un archivo html que contiene la identificación del
programa y del frotis, un enlace a una página de ayuda, otro para salir del
frotis, y una imagen orientadora del frotis, que permite ir a cinco puntos
dentro del frotis virtual (las cuatro esquinas y centro). Fue integrado un
“contador” de glóbulos blancos, para realizar el diferencial leucocitario,
desarrollado en el lenguaje JavaScrip (15,16). Este archivo fue
llamado “microscopio.html” y constituye el “microscopio virtual”. Los archivos
fotos.html y microscopio.html fueron integrados en una sola página web,
mediante la creación de marcos o frames(15) llamado “fvXX.html”, donde XX constituye el
código que identifica al frotis. La estructura del marco está compuesta en un
90% de la pantalla por el frotis, mientras que el microscopio se ubica en la
porción inferior de la pantalla, ocupando un 10% restante. En los diversos
tamaños de pantalla y navegadores probados (Explorer, Firefox, Opera, Chrome,
Safari) esta configuración fue satisfactoria.
Diseño del programa de
evaluación externa en morfología hemática virtual (PEEC MHV)
La intención del PEEC
fue evaluar la competencia en morfología hemática de los profesionales del
laboratorio clínico y constituye el resultado de la evolución de uno realizado
previamente con frotis físicos (17),
basado en las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (18).
El programa está
estructurado para desarrollarse por rondas, constituida por dos frotis
sanguíneos, codificados como 1101FV01 y 1101FV02 (AARR-FVXX, donde AA representa el año, RR la ronda y XX
el número del frotis). Se creó un
sitio web amigable, sencillo y liviano, cuyo contenido describe el programa,
contiene las instrucciones para su participación y alberga a los frotis
virtuales. El sitio web http://www.bioanalisisaldia.net/pueec_mhv/index.html fue
estructuralmente escrito en html y formateado mediante hojas de estilo en
cascada (15,16). Solo el envío del reporte fue escrito en lenguaje
php, el cual por medio de la función mail se enviaba, vía correo electrónico
los resultados al organizador (pueec.mh@gmail.com) y una
copia al participante (19). A fin de dar una identidad propia al
programa, se le denomino “Programa Universitario de Evaluación externa de la
Calidad en Morfología Hemática Virtual” (PUEEC MHV).
La fecha de distribución establece el inicio de la
observación del frotis sanguíneo virtual por parte del participante, la “fecha
límite de envío de resultados” se estableció en tres semanas, y un plazo de 30
días para el análisis y envío del informe final a cada participante, por parte
del organizador (fecha de entrega del informe final). Los participantes fueron
profesionales del laboratorio clínico del área de hematología que emplearan el
frotis sanguíneo dentro de sus procedimientos habituales, los participantes
debían tener habilidades computacionales mínimas, un computador con acceso a
internet y una cuenta de correo electrónico.
A fin de evaluar la competencia en morfología hemática, el
participante observó la morfología hemática y realizó el diferencial
leucocitario de un frotis sanguíneo virtual, del cual sólo podía reportar un máximo
de cinco hallazgos de un listado de 70 (20, 21). Los hallazgos
incluyeron anormalidades morfológicas de la serie roja: tamaño, forma, color e
inclusiones, distribución, presencia de elementos inmaduros; de la serie
blanca: número, inclusiones, variantes de leucocitos y elementos inmaduros;
plaquetas: número, tamaño, distribución y características celulares; y otros
elementos que pueden ser evidenciados en un frotis de sangre periférica, tales
como el Plasmodium. Aquellos términos que no definen u orientan de manera
importante lo observado en el frotis, fueron excluidos de la lista
(anisocitosis, poiquilocitosis). El diferencial leucocitario fue reportado de
la forma usual (en porcentaje en base a cien elementos).
La asignación del valor de referencia de la morfología
hemática y el diferencial leucocitario, fue dada por el consenso de un grupo de
árbitros (profesionales del laboratorio clínico de reconocida competencia en la
observación de frotis sanguíneos), que ingresaron al sitio web del PEEC previo
al inicio de la ronda, donde analizaron los frotis virtuales y reportaron sus
resultados según las instrucciones establecidas, los árbitros debían realizar
el diferencial de todos los glóbulos blancos del frotis virtual.
Para la morfología hemática se definieron los cinco
hallazgos (en caso de existir tal número) de la siguiente manera: a)
considerados de consenso aquellos hallazgos con una concordancia entre los
árbitros igual o mayor al 80% (22), b) hallazgos con menor
concordancia fueron discutidos en reunión hasta lograr el consenso mediante:
visualización del frotis virtual, revisando todos los reportes, opiniones, el
diagnóstico presuntivo y hematología completa; para definir su pertinencia. El
valor de referencia del diferencial leucocitario se estableció como el
intervalo de confianza del 95% para el valor consenso obtenido, definido como
la media aritmética de los árbitros para cada línea celular (redondeado al
valor entero). Se verificó la exactitud del recuento obtenido mediante el
empleo de gráficos de envolturas del 95% y 99% de confianza para un recuento
determinado, siguiendo los lineamientos de protocolo NCCLS H20-A (14).
A cada participante se le asignó un código de
identificación a fin de mantener la confidencialidad. Los resultados de la
morfología hemática del participante fueron
contrastados con el valor de referencia, por medio del cual se obtuvo su nivel
de desempeño. Se establecieron tres niveles
de desempeño (excelente, aceptable y pobre). Debido al carácter
educativo del programa se incluyó una recomendación acorde con el nivel de
desempeño obtenido, que pretendió guiar al participante a mejorar su
competencia en morfología hemática. Para el diferencial leucocitario sólo se incluyó el intervalo de confianza
al 95% para cada línea celular a fin de que el participante pueda realizar una
autoevaluación de sus resultados, salvo en aquellos casos en los que se
observaron resultados aberrantes que incluyó
también una recomendación.
A cada participante se le envío por correo electrónico un informe de
resultados de carácter confidencial que incluyó la siguiente información: total
de participantes que respondieron el ítem de ensayo, los resultados para
morfología hemática que incluyó los hallazgos morfológicos de referencia y los
señalados por el participante, un gráfico con los hallazgos señalados por todos
los participantes y los considerados de referencia, el desempeño obtenido para
la morfología hemática, las recomendaciones a seguir para mejorar su competencia
en morfología hemática, comentarios del Coordinador y resultados del
diferencial leucocitario (resultados de referencia, media de los participantes,
el intervalo de los participantes y los resultados individuales). Además se
realizó un informe final global, que fue colocado en el sitio web del programa
(sección resultados). La estadística descriptiva se realizó con el software
Microsoft Excel® 2010.
