El grupo de pacientes con dengue examinado en este trabajo estuvo constituido por 14 pacientes con dengue serológicamente comprobado. La detección de la infección fue realizada en el Instituto Nacional de Higiene, utilizando la metodología de Elisa (Tabla Nº1). Un segundo grupo utilizado como control, estuvo constituido por 5 personas clínicamente sanas.

Obtencion de las muestras
Las muestras de sangre se obtuvieron de pacientes hospitalizados en el servicio de Enfermedades Infecciosas del Hospital Universitario de Caracas. Los pacientes fueron previamente diagnosticados para dengue por clínica y serología, y ubicados dentro de los grupos del estudio. Se obtuvieron 6ml. de sangre periférica mediante punción venosa periférica y fueron mezclados con 9mg. de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) por inversión lenta (10x) en tubos al vacío preparados a tal efecto.

Procesamiento de la muestra para microcopia electrónica de transmision
El procesamiento de las muestras se hizo según la técnica de Watanabe⁴, modificada por Pirela y col.⁵. Las muestras fueron centrifugadas (600x g/15min./t.a.) en rotor basculante, extrayéndose posteriormente el plasma sobrenadante por aspiración con pipetas Pasteur. La capa superficial remanente del plasma fue separada de la fracción rica en leucocitos mediante la absorción con papel de filtro. El volumen de plasma retirado se sustituyó con glutaraldehido al 2,5% en amortiguador de cacodilato de sodio 0,1M, pH 7.2, mantenido a 4ºC y sacarosa al 6,0%, durante una hora. Esta preparación fue trasladada a un vidrio de reloj a temperatura ambiente en donde fueron separados manualmente la capa leucocitaria de los eritrocitos. La capa de leucocitos aislados por este procedimiento fue lavada con buffer cacodilato 0,1 M, pH 7.2 4ºC y sacarosa al 6,0% durante dos minutos para separar los glóbulos rojos adheridos. Luego, se cortó la capa de leucocitos en trozos de 1,0mm. aproximadamente para su fijación con glutaraldehido al 2,5% en buffer cacodilato 0,1 M, pH 7.2 y sacarosa al 6,0%, mantenida a 4ºC, durante 30 minutos. Al final de esta etapa, los bloques de leucocitos fijados fueron lavados (2x 15min.) con buffer cacodilato 0,1 M, pH 7.2 y sacarosa al 6,0% mantenida a 4ºC. Se procedió a aspirar la solución de lavado, las muestras fueron tratadas con tetraóxido de osmio (0s04) al 1%, en agua bidestilada, mantenida a 4ºC durante una hora. Luego se procedió a retirar esta solución y al lavado sucesivo con agua destilada.

Las muestras obtenidas fueron deshidratadas mediante gradientes ascendentes de etanol (50, 75, 85, 95, 100, 100 y 100%) por 15 minutos c/u. Los bloques fueron trasladados a óxido de propileno (2x 15min. c/u), e incluidas en resina LX 112 en las proporciones 3:1; 1:1; 1:3; en etapas de una hora de duración; para obtener la infiltración de la resina en la muestra. Finalmente, los bloques de leucocitos se trasladaron a un recipiente donde se mantuvieron en resina pura durante 24 horas. La inclusión de las muestras en las resinas se efectuó colocando los bloques de leucocitos en moldes adecuados junto con la resina. Estos moldes fueron trasladados a una estufa a 60ºC, durante 48 horas. Se practicaron de 2 a 6 pares de cortes finos (60-90nm.) a diferentes niveles, a cada uno de los 5 a 6 bloques de las preparaciones a ser examinados ultraestructuralmente, éstos fueron efectuados con cuchilla de diamante mediante un ultramicrotomo, marca Porter & Blum MT-2. Las muestras fueron contrastadas por tratamiento de acetato de uranilo al 2% durante 30 minutos en cámara húmeda y citrato de plomo por 15 minutos. Una vez contrastadas las muestras se observaron en un microscopio electrónico, marca Hitachi, modelo 500 (H-500) con un voltaje de aceleración de 85Kv. Las células fueron observadas y fotografiadas en aumento promedio de 4000 a 15.000x y en micrografías ampliadas a mayores aumentos se observaron los detalles de interés.