Este trabajo se realizó
en Maracaibo, Venezuela, en el curso de la última década, gracias a la
colaboración de otros Laboratorios de Patología del país. Inicialmente los seis
primeros casos fueron aportados por patólogos de la Policlínica Santiago
de León de Caracas y luego los demás casos llegarían aisladamente a nuestro
Laboratorio en el curso de varios años. Contribuyeron a lograr los resultados
presentados en este trabajo, los Laboratorios de Patología de la Policlínica Santiago
de León en Caracas y de las Dras Arenas y
Petrosino en Mérida. Por los motivos expuestos, no todos los casos pudieron ser
examinados con los mismos reactivos disponibles para las técnicas de biología
molecular. En 11 de los 15 casos logramos analizar la presencia del VPH usando
la técnica de hibridación in situ y precisar los subtipos de alto riesgo. Solo
en seis casos se realizamos estudios de hibridación in situ cromogénica
comparada (HGC) utilizando tres tipos de sondas centroméricas para los cromosomas
3, 17 y 18 y solo en cinco de estos casos obtuvimos resultados cuantificables.
Realizamos estudios de inmunohistoquímica para p53, p16, e-cadherina y p63 en
los 15 casos, pero estos resultados no se incluyen en este trabajo.
Para
la detección de VPH por hibridación in situ, utilizamos sondas biotiniladas de
ADN específicas para VPH. WS (de
amplio espectro: Wide Spectrum HPV Biotinylated DNA Probe-Código Y1404 de
DAKO ) que comprende los virus tipo
6,11, 16, 18, 31,33,35, 45, 51y 52 ; y
AR ( de alto riesgo: The GenPointâ„¢ HPV Probe-Código Y1443 de DAKO ) con los
virus tipo 16,18, 31,33,35,39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Las señales de la Biotina fueron demostradas
con el complejo primario de estreptavidina-peroxidasa, tiamina-biotinilada y
secundariamente estreptavidina-peroxidasa
(Sistema GenPoint para amplificación de la señal (DAKO).
Para
el estudio de Hibridación cromogénica (HGC) se seleccionaron seis (6) casos de NIA
y de cáncer del canal anal. Las muestras fijadas en formol tamponado al 10%,
fueron deshidratadas en alcoholes y se
incluyeron en parafina. Se examinaron histológicamente los casos y se
seleccionaron varios de ellos para su estudio.
En un microtomo de rotación, se realizaron cortes de los bloques de parafina
para practicar en ellos la técnica de Hibridación Genómica Comparada (HGC)
utilizando sondas centroméricas para los cromosomas 3, 17 y 18. El
procedimiento de hibridación in situ cromogénica se realizó en los cortes de
dos micras de espesor, colocados en una solución recuperadora precalentada a 98°C durante40 minutos.
Después de lavarlos con agua desionizada se hizo una digestión breve con
Proteinasa K 1/8.000. Los cortes en el agua desionizada fueron deshidratados
con etanol, y se secaron al aire. Se aplicaron 15 microlitros de las sondas
centroméricas correspondientes a los cromosomas 3, 17 y 18 ( Zymed SP.T-Light ®
) y se colocaron en un hibridizador durante 5 minutos a 95°C para su
desnaturalización. El proceso de hibridación se realizó durante 14 horas. Los
cortes se lavaron con PBS y se bloqueó la peroxidasa endógena con H2O2-metanol.
Tras un nuevo lavado, se hizo un bloqueo de proteínas ( CAS-LOCK TM)
por 10 minutos y la inmunodetección se hizo con un polímero de Estreptavidina
por 30 min. Los cortes fueron lavados nuevamente, se colocaron en DAB por
30min, se lavaron con agua, se deshidrataron en alcoholes se contrastaron con
hematoxilina, y fueron deshidratados y montados con medio de montaje.
En todos
los casos, en el material ya incluido en parafina, se hicieron cortes de dos a
tres micras de espesor en un microtomo de rotación, los cuales fueron teñidos
con hematoxilina y eosina y examinados en un microscopio de luz. En algunos
casos, antes del estudio inmunohistoquímico, se realizó la coloración de PAS
con el reactivo de Schiff usando digestión con diastasa para la observación del
glicógeno. Los cortes, de dos a cuatro micras fueron recogidos en el baño de
flotación usando láminas sialinizadas o cubiertas con poli-l-lisina previo
bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno-metanol. Para la
recuperación antigénica se utilizó una solución de citrato de sodio a pH 6, o
EDTA a pH 9, en olla de presión dentro
de un horno de microondas para elevar la temperatura hasta 100ºC durante varios minutos.
Se utilizó como cámara húmeda un sistema de capilaridad de Shandon y los
anticuerpos utililizados fueron de DAKO a las correspondientes diluciones. Se
examinaron en cada caso los siguientes anticuerpos: p16, p53, p63, E-cadherina
y ki 67 en todos los casos incluidos en este estudio. Resumen
de los casos examinados por Hibridación Genómica Comparada
1- 5637-2000**
Paciente femenina de 64 años con lesión en la mucosa anal.
Diagnóstico:
CARCINOMA ESCAMOSO BIEN DIFERENCIADO.
2-
6396-2000**
Paciente femenina de 74 años con tumor anal pruriginoso. Diagnóstico:
CARCINOMA
ESCAMOSO BIEN DIFERENCIADO DE TIPO BASALOIDE.
3- 4217-2002**
Paciente femenina de 82 años con tumor en el ano. Diagnóstico: CARCINOMA
ESCAMOSO
MODERADAMENTE DIFERENCIADO CON íREAS BASALOIDES.
4- 4055-2003**
Paciente femenina de 64 años con lesión tumoral en el canal anal.
Diagnóstico:
CARCINOMA ESCAMOSO BIEN
DIFERENCIADO.
5-
3714-2003** Paciente
femenina de 66 años con lesión condilomatosa y pruriginosa anal.
Diagnóstico:
CARCINOMA IN SITU/DISPLASIA SEVERA.
6- 6709-2004** Paciente femenina de 67 años con lesión
polipoide vellosa en anorecto.
Diagnostico: CARCINOMA ESCAMOSO POCO DIFERENCIADO CON EXTENSA
NECROSIS.
7- 0074-2005
Paciente femenina de 69 años. Con lesión de la región perianal.
Diagnóstico:
CARCINOMA
EPIDERMOIDE DEL CANAL ANAL, MODERADAMENTE
DIFERENCIADO,
INFILTRANTE.
8- 0076-2005
Paciente femenina de de 66 años con
tumor del recto. Diagnóstico:
CARCINOMA EPIDERMOIDE POCO
DIFERENCIADO INFILTRANTE.
9- 0651-2006
Paciente femenina de 61 años con tumor en la región anal. Diagnóstico:
CARCINOMA DEL CANAL ANAL
BASALOIDE.
10- 1551-2006
Paciente femenina de 70 años con tumor del canal anal resecado por
abdómino-perineal,
luego de radioterapia y quimioterapia. Diagnóstico:
CARCINOMA ESCAMOSO
MODERADAMENTE DIFERENCIADO CON
EXTENSA NECROSIS.
11- 1345-2007
Paciente femenina de 64 años con tumor en recto bajo. Diagnóstico:
CARCINOMA ESCAMOSO IN SITU.
12- 0069-2010
(+) Paciente femenina de 69 años con lesión
tumoral pigmentada del canal anal.
Diagnóstico: CARCINOMA DEL
CANAL ANAL.
13- 0684-2010 (+) Paciente femenina de 52 años con tumor del
canal anal. Diagnóstico:
CARCINOMA
DEL CANAL ANAL.
14-
1370-2010 (+) Paciente femenina de 84 años con tumor en
canal anal. Diagnóstico:
CARCINOMA
NEUROENDOCRINO DEL CANAL ANAL.
15- 0736-2011 (+)
Paciente femenina de 52 años con tumor en canal anal. Diagnóstico:
CARCINOMA DEL CANAL ANAL.
** : casos de la Policlínica Santiago
de León de Caracas. +: casos donde no se
pudo realizar la hibridación in situ para VPH