La mayoría de la investigación, que hemos discutido, se llevo acabo antes o poco tiempo después del descubrimiento de la vasodilatación endotelio dependiente por Robert Furchgott en 1980 (Furchgott and Zawadzki, 1980). El conocimiento de que la nitroglicerina era un vaso relajante tan potente y los hallazgos más recientes que demuestran que el óxido nítrico era un potente vasodilatador e inhibidor de la agregación plaquetaria, nos llevó a preguntarnos por qué los mamíferos tienen receptores para compuestos farmacológicos tan potentes. Esta idea sugería que quizás los mamíferos poseen un compuesto nitrogenado endógeno que libera óxido nítrico o poseen óxido nítrico. Los primeros estudios sobre el factor relajante derivado de endotelio (EDRF) se condujeron sin ningún conocimiento de su estructura química. Nosotros empezamos a estudiar la vasodilatación dependiente de endotelio, porque queríamos determinar si el GMP cíclico estaba involucrado y, no porque pensábamos que el EDRF podría ser óxido nítrico. De hecho, se estaba llevando a cabo un proyecto separado para encontrar óxido nítrico endógeno. Justamente, mientras completábamos nuestros experimentos sobre el EDRF y el GMP cíclico, el grupo de Ferid Murad publicaba un artículo en el que se mostraba que la vasodilatación endotelio dependiente por acetilcolina y otros agentes estaba asociada con la producción de GMP cíclico en el músculo liso vascular (Rapoport and Murad, 1983). Nosotros encontramos resultados similares y también encontramos que el azul de metileno, un inhibidor de la actividad de la guanilato ciclasa, prevenía tanto el efecto de acumulación de GMP cíclico como el efecto vasodilatador de la acetilcolina (Ignarro et al., 1984). Al principio entretuvimos la idea de que la acetilcolina podría estar estimulando la formación de un metabolito de ácido araquidónico, el cual de alguna manera activaba la guanilato ciclasa para elevar los niveles de GMP cíclico. Esta posición fue apoyada por estudios de éste y otros laboratorios, que mostraban que agentes que interfieren con la formación de ácido araquidónico y ciertos metabolitos del ácido araquidónico, también interfieren con la vasodilatación mediada por acetilcolina (Furchgott et al., 1981; Ignarro et al., 1984; Rapoport and Murad, 1983). Pero yo no estaba satisfecho con esta idea, porque los experimentos en mi laboratorio no demostraban que la guanilato ciclasa era activada por ninguna otra cosa que no fuera óxido nítrico. Después de revisar nuestros datos de nuevo, de repente nos dimos cuenta de que nuestro hallazgo, al demostrar que el azul de metileno prevenía tanto el aumento del GMP cíclico como la vasodilatación en respuesta a la acetilcolina, era similar a nuestro anterior descubrimiento sobre la prevención de la formación de GMP cíclico y de la vaso relajación en respuesta al óxido nítrico (Gruetter et al., 1981). Esto indicaba que la acción vasodilatadora de la acetilcolina era farmacológicamente similar a la del óxido nítrico. Sin embargo, tuvimos cuidado en no sugerir en el texto que el EDRF podría ser óxido nítrico. Luego, una vez que otros laboratorios demostraron que el EDRF era una molécula muy inestable (Gryglewski et al., 1986; Rubanyi and Vanhoutte, 1986), nos dimos cuenta de que los datos de varios laboratorios eran consistentes con nuestra opinión de que el EDRF y el óxido nítrico eran bastante similares. Los dos proyectos distintos en mi laboratorio, uno enfocado en EDRF/GMP cíclico y el otro enfocado en el óxido nítrico endógeno, eran convergentes pero todavía no estaban listos para proponer que el EDRF era óxido nítrico.

Una serie de experimentos fue diseñada para probar nuestra hipótesis - aun sin publicar- de que el EDRF podría ser óxido nítrico. El primer experimento era determinar si el EDRF, liberado de arterias y venas, podía activar la guanilato ciclasa y así explicar los niveles elevados de GMP cíclico en tejido, en respuesta a la acetilcolina o la bradikinina. Este estudio se publicó en 1986 (Ignarro et al., 1986b). Anillos arteriales y venosos se aislaron de vasos intrapulmonares bovinos y fueron incubados en mezclas de reacción, que contenían guanilato ciclasa citosólica purificada de pulmón bovino. La adición de acetilcolina a las mezclas de reacción que contenían los anillos arteriales, resultó en la activación de la guanilato ciclasa, y la bradikinina causó el mismo efecto en las mezclas de reacció, indistintamente de que tipo de anillos contenía. La activación de la guanilato ciclasa por la acetilcolina y la bradikinina, era dependiente de la presencia de un endotelio intacto en los anillos arteriales y lo anillos venosos, y la respuesta era bloqueada por azul de metileno y aumentada por antioxidantes. Estos experimentos revelaron que el EDRF de arterias y venas, activa a la guanilato ciclasa, mediante mecanismos que pueden ser inhibidos por azul de metileno y optimizados por antioxidantes. Claramente, los datos apuntaban hacia la posibilidad de que el EDRF es óxido nítrico o alguna sustancia relacionada químicamente, como un compuesto nitrogenado labil. El próximo experimento fue para determinar si la activación de la guanilato ciclasa por EDRF era hemo-dependiente, al igual que la activación enzimática por óxido nítrico. Experimentos similares a los descritos anteriormente, se repitieron utilizando guanilato ciclasa, que había sido purificada en su forma hemo-deficiente y en la forma de la enzima que contiene hemo. Como lo esperábamos, la activación de la guanilato ciclasa por EDRF, al igual que la activación de la enzima por óxido nítrico, era hemo-dependiente. Al finalizar el primero de esta serie de experimentos, sabíamos que lo teníamos. EDRF tenía que ser óxido nítrico. Pero yo quería conducir experimentos más definitivo, antes de irme al extremo de declarar que el EDRF es óxido nítrico. Un aparato de bioensayo en cascada fue ensamblado para estudiar las propiedades químicas y farmacológicas del EDRF liberado por arteria y vena, así como para comparar éstas con las propiedades del óxido nítrico. Estos experimentos revelaron una gran similitud entre el EDRF y el óxido nítrico, y se presentaron en varias conferencias en 1986 y a principios de 1987 (Ignarro, 1986; Ignarro et al., 1987a; Ignarro et al., 1986a) antes de su publicación en 1987 (Ignarro et al., 1987a; Ignarro et al., 1987b).

Hubo un experimento en particular que me convenció, sin lugar a dudas, de que el EDRF era óxido nítrico. Nos aprovechamos de un experimento que se había realizado previamente en mi laboratorio sobre la guanilato ciclasa, en el cual demostramos que ésta era una hemo-proteína, como la hemoglobina, que reaccionaba con el óxido nítrico para formar nitrosil-hemo, lo cual se hizo evidente mediante el monitoreo del cambio de espectro de absorción de la región Soret (Ignarro et al., 1982). Este análisis químico clásico provee pruebas de la presencia del hierro del hemo, y estableció a la guanilato ciclasa como una hemoproteína. Este hallazgo es impresionantemente similar a la producción de nitrito (NO2-) y nitrato (NO3-), a partir de arginina observada en macrófagos activados por citoquinas (Hibbs et al., 1987a; Hibbs et al., 1987b; Iyengar et al., 1987; Palmer et al., 1988). De hecho, estos estudios revelaron que el análogo estructural de la arginina, la NG-metilarginina, inhibe la formación de NO3- y NO2-, a partir de arginina en las células endoteliales. La confirmación de estas observaciones originales y la demostración inequívoca de la presencia de una enzima que cataliza la conversión de arginina a óxido nítrico y citrulina fue lograda por Bredt y Snyder (Bredt and Snyder, 1990). A la enzima se le llamó óxido nítrico sintasa y, este estudio originó una avalancha de investigación, que llevó a la caracterización de las isoformas de la enzima, su purificación, la descripción del mecanismo catalítico y la caracterización estructura-función de la óxido nítrico sintasa (Bredt and Snyder, 1994; Crane et al., 1997; Feron et al., 1998; Forstermann et al., 1994; Garcia-Cardena et al., 1997; Griffith and Stuehr, 1995; Presta et al., 1998; Salerno et al., 1996; Stuehr and Griffith, 1992).