Este trabajo se realizó en Maracaibo, Venezuela, en el curso de la última década, gracias a la colaboración de otros Laboratorios de Patologí­a del paí­s. Inicialmente los seis primeros casos fueron aportados por patólogos de la Policlí­nica Santiago de León de Caracas y luego los demás casos llegarí­an aisladamente a nuestro Laboratorio en el curso de varios años. Contribuyeron a lograr los resultados presentados en este trabajo, los Laboratorios de Patologí­a de la Policlí­nica Santiago de León en Caracas y de las Dras Arenas y Petrosino en Mérida. Por los motivos expuestos, no todos los casos pudieron ser examinados con los mismos reactivos disponibles para las técnicas de biologí­a molecular. En 11 de los 15 casos logramos analizar la presencia del VPH usando la técnica de hibridación in situ y precisar los subtipos de alto riesgo. Solo en seis casos se realizamos estudios de hibridación in situ cromogénica comparada (HGC) utilizando tres tipos de sondas centroméricas para los cromosomas 3, 17 y 18 y solo en cinco de estos casos obtuvimos resultados cuantificables. Realizamos estudios de inmunohistoquí­mica para p53, p16, e-cadherina y p63 en los 15 casos, pero estos resultados no se incluyen en este trabajo.

Para la detección de VPH por hibridación in situ, utilizamos sondas biotiniladas de ADN especí­ficas para VPH. WS (de amplio espectro: Wide Spectrum HPV Biotinylated DNA Probe-Código Y1404 de DAKO ) que comprende los virus tipo 6,11, 16, 18, 31,33,35, 45, 51y 52 ; y AR ( de alto riesgo: The GenPointâ„¢ HPV Probe-Código Y1443 de DAKO ) con los virus tipo 16,18, 31,33,35,39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Las señales de la Biotina fueron demostradas con el complejo primario de estreptavidina-peroxidasa, tiamina-biotinilada y secundariamente estreptavidina-peroxidasa (Sistema GenPoint para amplificación de la señal (DAKO).

Para el estudio de Hibridación cromogénica (HGC) se seleccionaron seis (6) casos de NIA y de cáncer del canal anal. Las muestras fijadas en formol tamponado al 10%, fueron deshidratadas en alcoholes y se incluyeron en parafina. Se examinaron histológicamente los casos y se seleccionaron varios de ellos para su estudio. En un microtomo de rotación, se realizaron cortes de los bloques de parafina para practicar en ellos la técnica de Hibridación Genómica Comparada (HGC) utilizando sondas centroméricas para los cromosomas 3, 17 y 18. El procedimiento de hibridación in situ cromogénica se realizó en los cortes de dos micras de espesor, colocados en una solución recuperadora precalentada a 98°C durante40 minutos. Después de lavarlos con agua desionizada se hizo una digestión breve con Proteinasa K 1/8.000. Los cortes en el agua desionizada fueron deshidratados con etanol, y se secaron al aire. Se aplicaron 15 microlitros de las sondas centroméricas correspondientes a los cromosomas 3, 17 y 18 ( Zymed SP.T-Light ® ) y se colocaron en un hibridizador durante 5 minutos a 95°C para su desnaturalización. El proceso de hibridación se realizó durante 14 horas. Los cortes se lavaron con PBS y se bloqueó la peroxidasa endógena con H2O2-metanol. Tras un nuevo lavado, se hizo un bloqueo de proteí­nas ( CAS-LOCK ^TM) por 10 minutos y la inmunodetección se hizo con un polí­mero de Estreptavidina por 30 min. Los cortes fueron lavados nuevamente, se colocaron en DAB por 30min, se lavaron con agua, se deshidrataron en alcoholes se contrastaron con hematoxilina, y fueron deshidratados y montados con medio de montaje.

En todos los casos, en el material ya incluido en parafina, se hicieron cortes de dos a tres micras de espesor en un microtomo de rotación, los cuales fueron teñidos con hematoxilina y eosina y examinados en un microscopio de luz. En algunos casos, antes del estudio inmunohistoquí­mico, se realizó la coloración de PAS con el reactivo de Schiff usando digestión con diastasa para la observación del glicógeno. Los cortes, de dos a cuatro micras fueron recogidos en el baño de flotación usando láminas sialinizadas o cubiertas con poli-l-lisina previo bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno-metanol. Para la recuperación antigénica se utilizó una solución de citrato de sodio a pH 6, o EDTA a pH 9, en olla de presión dentro de un horno de microondas para elevar la temperatura hasta 100ºC durante varios minutos. Se utilizó como cámara húmeda un sistema de capilaridad de Shandon y los anticuerpos utililizados fueron de DAKO a las correspondientes diluciones. Se examinaron en cada caso los siguientes anticuerpos: p16, p53, p63, E-cadherina y ki 67 en todos los casos incluidos en este estudio.

Resumen de los casos examinados por Hibridación Genómica Comparada

1- 5637-2000** Paciente femenina de 64 años con lesión en la mucosa anal. Diagnóstico:

CARCINOMA ESCAMOSO BIEN DIFERENCIADO.

2- 6396-2000** Paciente femenina de 74 años con tumor anal pruriginoso. Diagnóstico:

CARCINOMA ESCAMOSO BIEN DIFERENCIADO DE TIPO BASALOIDE.

3- 4217-2002** Paciente femenina de 82 años con tumor en el ano. Diagnóstico: CARCINOMA

ESCAMOSO MODERADAMENTE DIFERENCIADO CON í�REAS BASALOIDES.

4- 4055-2003** Paciente femenina de 64 años con lesión tumoral en el canal anal. Diagnóstico:

CARCINOMA ESCAMOSO BIEN DIFERENCIADO.

5- 3714-2003** Paciente femenina de 66 años con lesión condilomatosa y pruriginosa anal.

Diagnóstico: CARCINOMA IN SITU/DISPLASIA SEVERA.

6- 6709-2004** Paciente femenina de 67 años con lesión polipoide vellosa en anorecto.

Diagnostico: CARCINOMA ESCAMOSO POCO DIFERENCIADO CON EXTENSA

NECROSIS.

7- 0074-2005 Paciente femenina de 69 años. Con lesión de la región perianal. Diagnóstico:

CARCINOMA EPIDERMOIDE DEL CANAL ANAL, MODERADAMENTE

DIFERENCIADO, INFILTRANTE.

8- 0076-2005 Paciente femenina de de 66 años con tumor del recto. Diagnóstico:

CARCINOMA EPIDERMOIDE POCO DIFERENCIADO INFILTRANTE.

9- 0651-2006 Paciente femenina de 61 años con tumor en la región anal. Diagnóstico:

CARCINOMA DEL CANAL ANAL BASALOIDE.

10- 1551-2006 Paciente femenina de 70 años con tumor del canal anal resecado por

abdómino-perineal, luego de radioterapia y quimioterapia. Diagnóstico:

CARCINOMA ESCAMOSO MODERADAMENTE DIFERENCIADO CON

EXTENSA NECROSIS.

11- 1345-2007 Paciente femenina de 64 años con tumor en recto bajo. Diagnóstico:

CARCINOMA ESCAMOSO IN SITU.

12- 0069-2010 (+) Paciente femenina de 69 años con lesión tumoral pigmentada del canal anal.

Diagnóstico: CARCINOMA DEL CANAL ANAL.

13- 0684-2010 (+) Paciente femenina de 52 años con tumor del canal anal. Diagnóstico:

CARCINOMA DEL CANAL ANAL.

14- 1370-2010 (+) Paciente femenina de 84 años con tumor en canal anal. Diagnóstico:

CARCINOMA NEUROENDOCRINO DEL CANAL ANAL.

15- 0736-2011 (+) Paciente femenina de 52 años con tumor en canal anal. Diagnóstico:

** : casos de la Policlí­nica Santiago de León de Caracas. +: casos donde no se pudo realizar la hibridación in situ para VPH