Se analizaron 24
aislados provenientes de diversas muestras biológicas (úlceras corneales,
hisopado conjuntival, exudado conjuntival, lentes de contacto, heces y aspirado
de absceso cerebral). Previamente se
habían identificado según su morfología como Acanthamoeba spp, y se
mantuvieron en cultivo en medio de Chinchilla modificado (9), desde
su aislamiento hasta la fecha. La
nomenclatura empleada para su identificación fue acordada por los miembros de
este laboratorio, empleando la letra “A” precediendo a un número asignado. Los
aislados fueron: A1, A2, A3, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18,
A19, A20, A21, A22, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31.
Clasificación Morfológica
Se realizó la clasificación en
grupos, siguiendo los criterios propuestos por Pussard y Pons(10).
Caracterización Molecular (PCR-RFLP)
El ADN fue extraído de trofozoítos y
quistes obtenidos de medio de cultivo monoxénico de Chinchilla modificado,
incubado a 37°C por 72 horas. Los
trofozoítos y quistes colectados, se lavaron en tampón fosfato salino (PBS) pH
7.4, y fueron ajustados a una concentración determinada, mediante recuento en
Cámara de Neubauer. Posteriormente,
fueron resuspendidos en 300 µL de tampón de lisis, se almacenó durante 24 horas
a 0°C y el ADN se extrajo con minicolumna, según instrucción del fabricante (Wizard®, Promega,
USA).
La pureza y concentración del ADN se
determinó midiendo la absorbancia a 230, 260 y 280 nm; además se determinó la
relación 230/260 nm y 260/280 nm.
Se realizó la amplificación por PCR
de una región del gen que codifica la Subunidad Ribosomal menor 18S (ARNr SU
18S), empleando los iniciadores descritos previamente por Kong y Chung(17),
Acantha-for (5’ TTTGAATTCGCTCCAATAGCGTATATTAA3’) y Acantha-rev (5’
TTTGAATTCAGAAAGAGCTATCAATCTGT 3’), los cuales dan origen a amplificados
La mezcla de PCR se realizó a un volumen
final de 50 µL, con las siguientes concentraciones finales: 1X del tampón de
PCR; 0,2 mM de los dinucleótidos (dNTPs); 3,0 mM de MgCl2; 0,5 µM de cada primer y 1 unidad de Taq Platinium (Promega®, USA). La amplificación
de la PCR se realizó a 40 ciclos de 94 ºC por 45 segundos, 55 ºC por 60
segundos y 72 ºC por 1,5 minutos. Una
desnaturalización inicial a 94 ºC por 3 minutos y una fase de polimerización
final de 10 minutos a 72 ºC. Los
amplificados se corrieron en gel de agarosa al 2% en tampón TBE, junto con un
marcador de 100 pares de bases (pb) (Invitrogen®,
USA) y
revelado con SYBR safe (Invitrogen®, USA). Las concentraciones de los reactivos
para realizar la PCR y las condiciones de amplificación, fueron estandarizadas
previamente en el Laboratorio de Amibiasis-UCV (datos no publicados).
Los productos de
PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción (RFLP) Hinf I, Hha
I y Hae III (Promega®, USA), siguiendo las especificaciones de la casa
comercial. Los geles fueron
fotografiados con un trasluminador de LUV y comparados los perfiles
electroforéticos de bandas, con los descritos por Kong y Chung, 1996 (17).
Para obtener el
tamaño de los fragmentos de restricción, se midió la distancia recorrida por
cada una de los fragmentos del marcador de Pb y se relacionó con el tamaño en
pb en un sistema de coordenadas semilogarítmico. De esta forma, se obtuvo una recta la cual se
utilizó para extrapolar los fragmentos obtenidos de los aislados, luego del
RFLP.
Análisis
estadístico
El análisis
estadístico que se utilizó en esta investigación fue de tipo no paramétrico
debido al tamaño de la muestra. Dependiendo de las comparaciones a realizar se
empleó la prueba de Mann-Whitney U o Prueba exacta de Fischer, utilizando el
software SPSS versión 18. Se consideró
como estadísticamente significativo un valor de p<0,05.
