Las amibas de vida libre (AVL) son conocidas como amibas anfizoícas, debido a la capacidad que tienen de existir como organismos de vida libre en la naturaleza, como ocasionalmente invadir un hospedero y vivir como parásito. Están ampliamente distribuidas en la naturaleza, por lo que los humanos estamos en frecuente contacto con estas ellas ^(1,19).

Las AVL se reconocen como parásitos emergentes, y se justifica su búsqueda, por el creciente número de usuarios de lentes de contacto y de personas inmunosuprimidas, así como las dificultades de diagnóstico y tratamiento ⁽¹⁹⁾. Aunado a ésto, la creciente invasión humana de nuevos espacios perturbando los ecosistemas, que pueden afectar, la cantidad, la especie de microorganismos y sus nutrientes, lo que da la posibilidad de establecerse, colonizar y convertirse en patógenas para el hombre ⁽²⁰⁾. En consecuencia, todos éstos hechos nos obligan a continuar nuestros trabajos en el Laboratorio de Amibiasis y al perfeccionamiento de los métodos para evidenciarlos tempranamente.

Las amibas del género Acanthamoeba son las más frecuentes, incrementándose la prevalencia de la QA en las últimas décadas, con el aumento del uso de lentes de contacto ⁽²¹⁾. Sin embargo, hay entidades patológicas de menor prevalencia que la QA pero de alto índice de mortalidad, debido al rápido progreso y gravedad de la enfermedad, como la EGA Y DA ⁽²²⁾.

En Venezuela, no había sido posible establecer la identificación de especies de aislados considerados como Acanthamoeba spp., bien por la forma heterogénea de presentación morfológica del protozoario o por no contar con la tecnología, herramientas, información o recursos necesarios para llevar a cabo tal objetivo. En la actualidad, el único centro de referencia para el estudio de las amibas de vida libre es el Laboratorio de Amibiasis de la UCV, donde se hace el diagnóstico de género por morfología y métodos de cultivo, aunque ya se han implementado las metodologías basadas en Biología Molecular, siendo pioneros en este tipo de estudios y resaltando la importancia del conocimiento de estos protozoarios en la epidemiología de nuestro país.

Para esta investigación se analizaron 24 aislados de Acanthamoeba, a los cuales se les realizó un análisis morfológico y molecular con la finalidad de establecer la especie de cada uno de ellos. El análisis morfológico se hace de rutina en nuestro laboratorio ya que con la identificación hasta género, es posible instaurar un tratamiento ⁽⁴⁾. Kong HH, 2009, señala que la observación de los cultivos sigue siendo el método más usado y que deben usarse varios métodos simultáneos, para el hallazgo de Acanthamoeba, en la misma muestra ⁽¹¹⁾ y otros autores consideran que aún se mantienen los criterios morfológicos de Pussard y Pons 1977 para la identificación morfológica. ⁽⁹⁾

Ninguno de los aislados se ubicó dentro del grupo I según Pussard y Pons ⁽¹⁰⁾, ya que todos los quistes median menos de 18um. La cantidad de puntas donde el ectoquiste hace contacto con el endoquiste y el aspecto del ectoquiste, permitió ubicar a los aislados dentro de los grupos II y III. Al relacionar la morfología de los quistes, con el tamaño de los productos de PCR obtenidos, se observó que existe concordancia entre la presencia de quistes lisos (grupo III) con un producto de 700 pb y la presencia de quistes festoneados o plegados (Grupo II), con la amplificación de un producto de 900 pb (p=0,005).

Los aislados A1, A3, A10, A11, A16, A17, A18, A19, A20, A21 Y A22 se ubicaron en el grupo III, además comparten entre sí, la cualidad de que sus productos amplificados por PCR fueron de 700 pb; un tamaño en pb inferior al esperado de 900 pb, según Kong y Chung 1996 ⁽¹⁷⁾. El otro grupo, correspondiente a los aislados A2, A9, A12, A13, A14, A15, A25, A26, A27, A28, A29, A30 y A31, mostraron características morfológicas distintas al grupo anterior: quistes con ectoquiste liso o plegado (en su mayoría plegados), significativamente con más puntas y trofozoítos relativamente más grandes, así como productos de amplificación por PCR para género de 900 pb. Tal heterogeneidad fue inesperada en los resultados a nivel molecular, ya que se escogió en la literatura los cebadores utilizados por Kong y Chung ⁽¹⁷⁾, debido a que para el género se podría esperar una pequeña variación entre 910 y 930 pb, para la mayoría de las especies de Acanthamoeba, excepto A. astronixys, en la cual se podría obtener un producto amplificado de 1170 pb.

Es posible que los resultados obtenidos para los aislados del grupo III, se deban a una alteración de la región altamente conservada que pudo haber modificado las características fenotípicas de estos aislados. Estadísticamente, se pudo observar una tendencia a obtener productos de PCR de 700 pb, en aislados mantenidos en cultivo más 10 años.

Una de las principales ventajas de realizar un estudio basado en el análisis del gen que codifica para la sub-unidad ribosomal, es que, al ser una estructura molecular que posee gran estabilidad con el paso del tiempo, presenta cambios estructurales pequeños e independientemente de éstos, es posible la identificación de especies, incluso aquellas estrechamente relacionadas. Sin embargo, numerosos estudios han comprobado que la porción analizada en este estudio (18S) poseen áreas de ADN no codificantes o intrones que pueden alterar la estructura genética, modificar el tamaño de los amplificados por PCR y por lo tanto afectar la correcta interpretación del mismo ^(17,18). Esto claramente, constituye un problema a la hora de comparar con los patrones de referencia y procurar la identificación de las especies.

Un factor posiblemente determinante en este estudio es la antigüedad de los aislados, pues estos protozoarios tienen la capacidad de cambiar sus características morfológicas y metabólicas de acuerdo al tiempo, temperatura de mantenimiento y las condiciones de cultivo ⁽¹⁹⁾.

La identificación de las especies mediante RFLP se logró en un 33% del total de los aislados seleccionados mantenidos en el Laboratorio de Amibiasis de la Escuela de Bioanálisis. Las especies identificadas fueron A. castellani para A26, A27, A28 y A29, polyphaga para A9, A12, A13 y A14 y se obtuvo patrones solapados, para A15, A25 y A30 impidiendo su identificación definitiva, siendo compatible con los patrones de A. castellani y A. polyphaga. Por otra parte, estos resultados se corresponden muy bien con las especies agrupadas por Pussard y Pons ⁽¹⁰⁾, que indican que las posibles especies para el género Acanthamoeba que exhibían características morfológicas compatibles con miembros del grupo II pueden ser A. castellani y/o A. polyphaga.

La clasificación de Pussard y Pons ⁽¹⁰⁾, además de diferenciar los quistes, logra agrupar ciertas especies, de modo que las que se encuentran en el grupo II comprenden un amplio grupo entre las que se hallan Acanthamoeba polyphaga y Acanthamoeba castellanii, y son en conjunto con las del grupo III, los patógenos más comúnmente aislados de muestras clínicas a nivel mundial ⁽²²⁾.

El 50% de los aislados seleccionados para este proyecto, no presentó productos de digestión similares a los patrones de digestión con cada una de las enzimas publicadas por Kong y Chung 1996 ⁽¹⁷⁾. Sin embargo, algunos de los aislados con productos de PCR de 700 pb, generaron patrones de digestión semejantes entre sí con las enzimas de restricción Hinf I y Hae III, aun cuando ésto no permitió su clasificación.

En el caso de A31, a pesar de que se obtuvo un producto de PCR de 900 pb, el rendimiento de RFLP no logró ajustarse tras varios intentos, habiendo esto impedido la posibilidad de la identificación.

Como se demuestra en este estudio, si bien no es posible determinar las especies de Acanthamoeba, sólo por el estudio microscópico, existen diferencias estructurales que avalan la clasificación de 1977, en grupos morfológicos y dichos grupos además presentan diferencias genéticas importantes, lo cual facilita la diferenciación y en último término la identificación y genotipificación de los mismos.

A futuro, en el Laboratorio de Amibiasis de la Escuela de Bioanálisis de la UCV, el estudio del genotipo, mediante la secuenciación del gen codificante del ARNr 18S de los aislados mantenidos, esclarecerá si éstos se corresponden con los genotipos más virulentos. Este hecho constituye un pilar relevante de la presente investigación, pues propone la posibilidad, de establecer un protocolo clínico que permita la instauración de la terapia adecuada en cada caso por el médico tratante, tal como lo sugiere Sissons y cols., ⁽²³⁾ quienes establecen, que se requiere realizar pruebas moleculares para saber si la amiba encontrada pertenece a una especie patógena conocida y así conocer el riesgo para el paciente, sobre todo para usuarios de lentes de contacto.