Debido a su flexibilidad, Leishmania adapta su metabolismo e infectividad a diversas condiciones de estrés, como es el caso de la presión constante de dosis sub-óptimas de fármacos (García y col, 2000; Uzcátegui y col, 2005; Machuca y col, 2006). Como consecuencia, el parásito desarrolla quimio-resistencia. Al igual que los virus y las bacterias, los parásitos implementan mecanismos para adaptarse a las diferentes condiciones adversas en las que les toca vivir y sobrevivir en ellas exitosamente (por ejemplo hacerse quimio-resistentes). La implementación de estos mecanismos implican un costo de adaptación que en la literatura internacional se denomina en general "fitness cost" (Natera y col, 2007). En Leishmania, el concepto de "fitness cost" describe con frecuencia asociada a cambios en la virulencia, marcador fundamental para la supervivencia y patogénesis del parásito, tanto en el vector como en el hospedero (Beverley, 2001). El concepto de "fitness cost" también se ha relacionado en Leishmania con la inducción de muerte celular programada que ocurre luego de ser inoculados los parásitos al hospedero mamífero; en este caso, el costo de adaptación se interpreta como una manera de permitir la supervivencia del "más apto" y garantizar la transmisión al próximo hospedero (Debrabant y Nakhasi, 2003). Como mencionamos anteriormente, el único método confiable para monitorear quimio resistencia en parásitos aislados de pacientes es el modelo in vitro amastigote-macrófago. Debido a que ésta es una técnica laboriosa y costosa, así como al aumento de la incidencia de casos de leishmaniasis que no responden eficazmente a los medicamentos, urge identificar marcadores moleculares de resistencia fáciles de utilizar en el laboratorio de rutina y que puedan guiar la terapia leishmanicida (Croft, 2006; Natera y col, 2007). Los cambios funcionales que ocurren en Leishmania como consecuencia del desarrollo de quimio-resistencia pudieran ser el resultado de un costo de adaptación y su evaluación sistemática podría orientarnos a identificar si los mismos pudieran ser usados como marcadores clínicos de la presencia de cepas resistentes en los pacientes infectados (Ponte Sucre, 2003; Natera y col, 2007). Debido a ello, en el Laboratorio de Fisiología Molecular hemos identificado fenómenos multifactoriales: genéticos, bioenergéticos y funcionales, que constituyen cambios que acompañan al desarrollo de resistencia del parásito en modelos de infección. Los resultados sugieren que los parásitos resistentes cambian sus preferencias metabólicas, la expresión de proteínas de superficie y su capacidad de diferenciación e infectividad con la finalidad de mantener el fenotipo quimio-resistente. Sería interesante desde el punto de vista farmacológico validar los resultados obtenidos en el laboratorio con estas cepas de referencia mantenidas en cultivo, en aislados de parásitos de lesiones de pacientes con su fenotipo silvestre intacto. Es decir, demostrar si los parásitos silvestres presentan algunas de las características evidenciadas en los parásitos de referencia seleccionados como quimio-resistentes. Para efectos de esta revisión mencionaremos algunas de estas herramientas que consideramos podrían ser las más valiosas por la sencillez de las metodologías de evaluación y su posible utilidad en el laboratorio de diagnóstico. Los eventos celulares que acompañan a la resistencia a drogas en Leishmania incluyen el aumento de la expresión de transportadores ABC, quienes modulan la salida y el transito intracelular de los agentes quimioterapeuticos, cambios en la diferenciación y la virulencia de la célula y cambios en vías metabólicas específicas del parásito. La evaluación de algunos de estos eventos es relativamente fácil y representan métodos rutinarios de laboratorio por lo cual sería extremadamente importante evaluar si cambios en la expresión de marcadores celulares se correlacionan con la expresión de resistencia a drogas en pacientes.

La acumulación celular de la calceina y su derivado hidrofóbico la calceina-acetoxymetil ester (CAL AM), así como su inhibición por compuestos específicos como el verapamil permiten cuantificar la actividad de los transportadores ABC. Se ha propuesto que el aumento de la actividad de estos transportadores es confirmatorio del concepto de resistencia a drogas; sin embargo, en cepas de referencia de Leishmania se ha demostrado que estos sistemas están constitutivamente expresados (Essodaigui y col, 1994; Machuca y col, 2006), y no necesariamente validan el fenotipo de quimio-resistencia en este parásito, es decir, que no necesariamente representan lo que ocurre en las cepas silvestres. En Leishmania, la diferenciación celular y adquisición de la virulencia, o su equivalente, la metaciclogénesis, es un proceso durante el cual ocurren cambios coordinados del metabolismo y la morfología que se correlacionan con la transformación de parásitos de no infectivos a infectivos. La metaciclogenesis está vinculada a lapsos específicos de la cinética de crecimiento y a la densidad celular. Cuando los parásitos en fase logarítmica entran en la fase estacionaria ellos se transforman; la nueva forma recuerda ampliamente la fase metacíclica de crecimiento. Sería interesante evaluar si alteraciones de la cinética de crecimiento representan modificaciones en la diferenciación y la virulencia de la célula y si existe una asociación entre estos dos parámetros y la resistencia a drogas. Por ejemplo, la cinética de crecimiento de L. amazonensis sensibles a drogas difiere de la cinética de crecimiento de parásitos resistentes a drogas crecidos bajo la presión de la droga. (Uzcategui y col, 2005; Machuca y col, 2006). Al ser cultivados en ausencia de la droga, los parásitos resistentes crecen mas rápidamente que los parásitos salvajes, implicando que tienen una mayor capacidad de replicación (Bates y col, 2003). Por otra parte, existen evidencias que sugieren que la resistencia a drogas puede estar asociada a una disminución de la infectividad en algunas cepas. Este es el caso de las cepas de L. mexicana resistentes a anfotericina B (Al-Mohamed y col, 2005), L. mexicana amazonensis resistente a transportadores ABC (Gazola y col, 2001; Silva y col, 2004), L. (V.) guyanensis resistente a glucantime (Gazola y col, 2001), y L. major resistente a ricino (Elhay y col, 1990; Cappai y col, 1994). Al contrario, L. mexicana amazonensis resistente a tunicamicina, una droga no relevante para el tratamiento de la leishmaniasis, expresa una virulencia inmutable o aumentada al compararla con la cepa silvestre (Kink y col, 1987; Detke y col, 1988; Sereno y col, 1997a, 1997b). Como Leishmania exhibe un amplio rango de velocidad de replicación, aún en ausencia de cambios genéticos asociados a quimio-resistencia, la velocidad de replicación y cambios de la misma, constituye posiblemente un parámetro independiente no vinculado a la resistencia a drogas por lo cual, el ensayo de crecimiento no sería predictivo de la condición física del parásito. Los parásitos metacíclicos deben poseer cuerpos pequeños y delgados (Bates y Tetley, 1993; Zakai y col, 1997). Sin embargo, las células resistentes en fase estacionaria tienen una mayor longitud y área que las células sensibles (Prasad y col, 2000, Silva y col, 2001, 2004). Adicionalmente, las células resistentes en fase estacionaria son más sensibles al complemento del suero humano que las células resistentes. Esto sugiere una modificación de la expresión de los carbohidratos de superficie (Prasad y col, 2000, Silva y col, 2001, 2004). Finalmente, los parásitos resistentes expresan menos META-1 que las células sensibles (Silva y col, 2001, 2004). Este marcador es el producto del gen meta-1 descrito originalmente en L. major (Nourbakhsh y col, 1996). Este es un marcador muy conservado en las cepas del Viejo y Nuevo mundo y esta predominantemente expresado en parásitos metacíclicos de Leishmania (Nourbakhsh y col, 1996; Berberich y col, 1998). Sería interesante analizar si en pacientes infectados con Leishmania, cambios en la expresión de estos marcadores se correlacionan con la ineficacia de la terapia y con la infección con parásitos resistentes.

Muchas vías metabólicas de Leishmania están íntimamente involucradas con la virulencia del parásito. Este es el caso de la enzimas pteridina reductasa y tripanotiona reductasa (Figarella y col, 2003; Ponte-Sucre 2003). No se sabe a ciencia cierta si cambios en la expresión de estas u otras vías metabólicas pueden predecir cambios en la célula asociados a la resistencia a drogas. Por ejemplo, y en relación a la glicólisis, se ha descrito que parásitos quimio-resistentes en fase exponencial de crecimiento utilizan menos glucosa como substrato energético, y presentan una menor expresión del transportador de glucosa. Sin embargo, los parásitos en fase estacionaria, utilizan mas amino ácidos como sustratos energéticos que los parásitos sensibles, y tienen aumentada la actividad de enzimas como la hexoquinasa, la fosfoglucosa isomerasa y especialmente la glutamato deshidrogenada asociada a NAD⁺ (Blum, 1993, 1994; Uzcategui y col, 2005; Machuca y col, 2006). Se podría postular entonces que la resistencia a drogas activa el uso de la fosforilación oxidativa, ya que la glutamato deshidrogenada regulada por NAD⁺ reorienta los metabolitos de los amino ácidos hacia el ciclo de Krebs (Urbina, 1994). Sin embargo, la producción de ATP es similar en los parásitos sensibles y resistentes a drogas (Singh y Lee, 1999). Esta observación implica además que en parásitos en fase exponencial de crecimiento las actividades de las enzimas al comienzo de la vía glicolítica no dependen de la velocidad de incorporación de glucosa y por lo tanto no estarían relacionadas con la infectividad de la célula. Es decir, que la presión continua de drogas induce al parasito a seleccionar vías metabólicas específicas que le permiten compensar los defectos primarios producidos por la presión de la droga; esto implica que estos cambios en las vías metabólicas no servirian como predictores de resistencia a drogas. Sin embargo, seria interesante analizar si en aislados de parásitos obtenidos de pacientes infectados existe una correlación entre el éxito de la terapia y la infección con parásitos resistentes a drogas y una menor tasa de incorporación de glucosa durante la fase exponencial de crecimiento.

Como conclusión final queremos resaltar que la identificación de marcadores de resistencia en Leishmania se hace cada día más importante debido al incremento constante de la frecuencia de aparición de casos de pacientes con fracaso terapéutico por causas imputables al desarrollo de quimio resistencia de los parásitos infectantes. Su valor de pronóstico para el resultado de tratamiento podría ser muy útil, especialmente si su implementación fuese confiable, económica y sencilla de implementar en el laboratorio diagnóstico.

 

Los autores agradecen el financiamiento de la Coordinación de Investigación de la Facultad de Medicina y el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la UCV a los proyectos que respaldan esta publicación. Así mismo agradecen el apoyo brindado por la Coordinación de Investigación de la Facultad de Medicina de la UCV y por FONACIT a Maritza Padrón Nieves, y el apoyo de la Fundación Humboldt a la Profesora Alicia Ponte-Sucre